研究背景：肝纤维化是指各种致病因素引起的肝脏损害和炎症，在修复过程中导致肝细胞外基质(ECM)异常增多和过度沉积的病理过程，肝纤维化既是一种代偿修复反应，又是肝损害的促进因素，它遵循反复肝组织损伤机制，其持续发展可逐渐演进至肝硬化甚至肝癌，预后极差。肝星状细胞（HSC）的激活被公认为是肝纤维化发生和发展的关键环节。活化后的HSC是肝脏ECM的主要生成细胞，并通过各种机制抑制ECM的降解，导致肝窦毛细血管化及小叶内纤维化。肝星状细胞激活的机制尚未明确，参与HSC激活过程的因素主要有ECM成分和结构的变化、生长因子、细胞因子、趋化因子、氧化性应激产物等，涉及到复杂的信号转导调控网络。因此寻找抑制肝星状细胞激活、促进肝星状细胞凋亡的途径是防治肝纤维化的重要策略。如能采用某种方法对肝纤维化进行逆转，则对肝病患者的预后将有极大的改善，目前广泛应用于逆转肝纤维化的有效途径包括消除原发病，抑制胶原的产生和加速其降解，抑制肝星状细胞（HSC)的激活和促进其凋亡。其中抑制HSC的激活因其从基因角度阻断纤维化途径的彻底性，已越来越受到国内外研究机构的重视。实验选用中药单体大蒜素（Allitridum），化学名为二烯丙基三硫化物（DATS），来源于百合科多年生草本植物－大蒜，是大蒜中主要有效成分，已证实具有抗氧化、保护肝细胞、抗感染以及抗肿瘤等多方面的作用。但是其抗肝纤维化的作用国内外少见报道，是近年来新发现的药理作用之一，其抗肝纤维化的作用机制及其作用的具体阶段亦尚不清楚，因此，本研究拟从体外实验和体内实验角度探讨大蒜素抗肝纤维化的作用及其分子发生机制。　　第一部分体外研究:大蒜素（DATS）对肝星状细胞（HSC）在细胞增殖、凋亡、细胞外基质合成相关基因和蛋白表达等方面的影响。　　目的:在体外环境下，观察大蒜素（DATS）对肝星状细胞（HSC）在细胞增殖、凋亡、细胞外基质合成相关基因和蛋白表达等方面的影响。从细胞学、差异基因组学、蛋白组学角度揭示DATS对HSC凋亡和胶原合成功能的影响。　　方法：将大鼠肝星状细胞株 HSC-T6于体积分数为10％小牛血清及1×105IU/L的青霉素、100mg/L的链霉素的DMEM培养液中，在37℃、5% CO2饱和蒸汽的条件下进行培养。并分为以下4组：溶剂对照组（DMSO）、DATS低剂量组（DATS6μg/ml）、DATS中剂量组（DATS12μg/ml）、DATS高剂量组（DATS24μg/ml）。　　1.倒置显微镜下观察各组细胞形态的变化。　　2.MTT法检测各组细胞的增殖情况。　　3.透射电镜观察24μg/ml大蒜素作用12 h后的HSC-T6细胞超微结构的变化。　　4.流式细胞术检测24μg/ml大蒜素作用6、12、24 h后对HSC-T6细胞凋亡和细胞周期的影响。　　5.qRT-PCR检测大蒜素对HSC-T6细胞凋亡及细胞外基质合成相关基因表达的影响。　　6. Western-blot检测大蒜素对HSC-T6细胞凋亡及细胞外基质合成相关基因的蛋白表达影响。　　7.运用基因芯片技术和生物信息学分析24 ug/ml大蒜素作用12 h后HSC-T6细胞的差异表达基因谱，qRT-PCR验证部分基因表达。　　8.荧光差异显示双向凝胶电泳技术检测24 ug/ml大蒜素作用12 h后HSC-T6细胞差异蛋白的表达。　　结果：　　1.光镜观察可见对照组HSC-T6细胞呈卵圆形或长梭形，贴壁生长，轮廓清晰，可见多角伪足，有的细胞成典型星芒状。经大蒜素作用12 h后，细胞密度变小，大部分细胞体积变小，细胞皱缩，伪足消失，少数细胞胞浆浓缩致密，呈小圆形，出现凋亡的形态学改变，并随着剂量的加大其变化更明显。　　2. MTT氮唑盐比色实验结果显示： DATS6μg/ml、12μg/ml、24μg/ml组均能明显抑制 HSC-T6细胞的增殖，与对照组比较差异明显，DATS24μg/ml组与DATS6μg/ml、12μg/ml组比较差异明显，呈明显的剂量依赖性关系。并且随着DATS作用时间的延长，HSC-T6细胞的增殖抑制率逐渐上升，呈明显的时间依赖性关系。　　3.正常的HSC核膜完整，染色质均匀分布在核中，胞浆中各种细胞器清晰可见，DATS诱发凋亡的HSC体积变小,染色质凝集、固缩,聚集于核膜下呈境界分明的块状或新月体形,有的可见核碎裂及凋亡小体形成。　　4. DATS24μg/ml作用HSC-T6细胞6 h后凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义，12、24 h后凋亡率均明显高于对照组。细胞周期分析发现24 h后HSC-T6细胞出现明显的G2/M期阻滞现象。　　5.凋亡相关基因：与对照组比较，DATS12μg/ml组作用12h后，p53、Bax基因表达明显升高；24h后Caspase3表达明显升高。细胞外基质合成相关基因：与对照组比较，DATS12μg/ml、24μg/ml组MMP-13基因表达明显升高，TIMP-1、MAO基因表达明显降低。　　6.凋亡相关蛋白：与对照组比较，P53蛋白的表达水平逐渐升高。细胞外基质合成相关基因蛋白：与对照组比较，MMP-13蛋白的表达水平逐渐升高，COL I、α-SMA蛋白的表达水平逐渐降低。　　7.获得差异表达基因425条。其中上调表达基因180条，下调表达基因245条。分为10类，大部分与糖代谢，脂肪代谢，蛋白质合成和电子传递过程有关。其中促进细胞凋亡的相关基因 p53、Bax、caspase3均表达上调，促进细胞外基质合成的基因TIMP-1、 Egln1、Egln2、Egln3、Plod1均表达下调。 DAVID数据库分析结果表明，差异基因的表达与细胞通讯的黏着斑、 Toll-like受体信号通路、JAK-STAT信号传导通路、细胞色素P450的代谢通路等有关，进一步IPA数据库分析差异基因的表达与肝纤维化的关系，发现其与Wnt/β-catenin信号通路、eNOS信号通路、PDGF信号通路以及活性氧介质（ROI）的产生有关，其中前三条信号通路均与 HSC的活化有关，活性氧的产生与肝细胞的损伤有关。 qRT-PCR验证部分基因表达与基因芯片中的检测结果一致。　　8.获得差异表达的蛋白质21个，其中表达上调的蛋白12个，表达下调的蛋白9个。按其功能可分为与核酸修复、细胞增殖与凋亡、基因转录与表达、代谢相关以及功能尚不清楚的蛋白质。其中14个蛋白均与细胞凋亡直接或间接相关。包括膜联蛋白A3（Annexin A3）、核基质蛋白（NPM）、延伸因子1-delta（Elongation factor1-delta）、热休克蛋白75（Grp75）、乙醛脱氢酶2（Aldehyde dehydrogenase2）等。　　结论:　　1.大蒜素（DATS）能抑制HSC-T6细胞的增殖，促进其凋亡。　　2.大蒜素（DATS）诱导HSC-T6细胞凋亡的机制与Bcl-2/Bax的比值下降以及 p53基因的表达升高有关。　　3.大蒜素（DATS）通过上调HSC-T6细胞MMP-13基因的表达、下调TIMP-1、 MAO、α-SMA和COL I基因的表达，抑制细胞外基质的合成，促进其降解，从而阻止肝纤维化的进一步发展。　　4.基因组学的研究结果显示大蒜素诱导HSC-T6细胞凋亡的机制与p53、Bax、Caspase3基因表达上调有关，细胞外基质的降解与TIMP-1基因的下调有关。差异基因表达所引起的信号通路的功能变化主要集中于以下5个方面：①诱导HSC的凋亡;②抑制HSC的活化;③抑制细胞外基质的合成;④减轻活性氧对肝细胞损伤;⑤改善肝窦的微循环该药物基因组差异图谱为进一步研究和分析大蒜素抗肝纤维化的作用靶点及作用机制研究提供了重要线索。　　5.蛋白组学的研究结果显示大蒜素抗肝纤维化的作用机制与诱导HSC-T6细胞凋亡密切相关，其中膜联蛋白A3（Annexin A3）、热休克蛋白75（Grp75）与细胞凋亡直接相关，为进一步研究其分子机制奠定了基础。　　第二部分体内研究:大蒜素对大鼠肝纤维化的保护效应及对TGF-β/smad信号传导通路的影响　　目的：研究大蒜素（Allitridum）对四氯化碳（CCl4）所致大鼠肝纤维化的防治效果，并探讨其对TGF-β/smad信号传导通路的影响。　　方法：将43只wister大鼠随机分为6组，雌雄各半。空白对照组（n=4）：不做任何处理，自由饮食、饮水；溶剂对照组（n=7）：予植物油灌胃及腹腔注射；模型组（n=8）：予植物油灌胃，CCl4油溶液腹腔注射；大蒜素小剂量预防组（n=8）：予大蒜素11mg·kg-1·d-1，CCl4；大蒜素中剂量预防组（n=8）：予大蒜素22 mg·kg-1·d-1，CCl4；大蒜素中剂量治疗组（n=8）：予大蒜素22 mg·kg-1·d-1，CCl4。用植物油将CCl4配成40%的油溶液，按1ml· kg-1·次-1腹腔注射，每周2次，共8周；用植物油将大蒜素分别配成相应浓度，按10ml· kg-1·次-1灌胃给药，除大蒜素中剂量治疗组在模型建立第5周给药（共连续4周），余各组在建模开始时给药（共连续8周）。所有大鼠在整个实验期间均喂标准食料，自由饮水。实验结束后腹主动脉取血制备血清，采血后取肝脏左叶常规固定备用。以ELISA法检测血清中ALT、AST、P INP、P IIINP、CTGF、TGF-β、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3、 Smad7的表达水平。肝组织作常规石蜡切片、HE染色、天狼猩红染色，镜检观察肝细胞变性、胶原纤维增生程度。　　结果：　　1.与空白对照组比较，溶剂对照组各项指标差异无统计学意义。与空白对照组、溶剂对照组比较，模型组ALT、AST、P I NP、P IIINP、CTGF、TGF-β、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3的表达水平均明显升高，Smad7的表达水平明显降低。与模型组比较，大蒜素各治疗组ALT、AST、P I NP、P IIINP、CTGF、TGF-β、α-SMA表达水平均明显降低。其中中剂量预防组Smad2/3、p-Smad2/3的表达水平均明显降低，Smad7的表达水平均明显升高;中剂量治疗组Smad2/3的表达水平明显降低，p-Smad2/3的表达水平降低，Smad7的表达水平明显升高。小剂量预防组p-Smad2/3的表达水平明显降低。　　2．肝组织HE染色和天狼猩红染色结果显示，空白对照组、溶剂对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐；模型组肝小叶结构被破坏，汇管区纤维组织明显增生并伸入小叶将肝小叶分割，形成完全或不完全假小叶；大蒜素预防及治疗组肝小叶结构完整，肝组织汇管区及小叶内散在点状、星芒状纤维组织增生，纤维间隔形成，但小叶结构大部分保存，肝细胞变性与胶原纤维增生程度明显减轻。　　结论：　　1.大蒜素具有抗肝纤维化作用:①大蒜素下调肌动蛋白α的表达，抑制了HSC的活化。②大蒜素下调I型前胶原肽、III型前胶原肽的表达，抑制了细胞外基质的合成。③大蒜素减轻肝组织胶原纤维的增生程度，延缓了纤维化的形成进程。　　2.大蒜素通过抑制TGF-β及TGF-β/smad信号通路的传导，阻止HSC的激活、促进其凋亡，从而发挥抗肝纤维化的作用。　　3.大蒜素同时有保护肝细胞，改善肝功能的作用。　　上述实验结果均提示大蒜素在预防及治疗肝纤维化的过程中具有积极的作用，大蒜素可能会成为治疗肝纤维化的一种新选择。