盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)是肉质化的一年生稀盐盐生植物。盐地碱蓬在滨海的潮间带或者部分涝洼积水地带在整个生长期植株地上部分皆为紫红色,而在地势较高或者距离海边较远的盐碱地植株则呈现绿色。作为一种强耐盐的真盐生植物,其耐盐机制十分复杂。目前对盐地碱蓬抗逆特别是抗盐机制的研究已经深入到生化及分子水平。我们实验室以前的研究结果证明盐地碱蓬中的红色素为甜菜红素。但是,盐地碱蓬中甜菜素合成的分子机理和相关基因的表达调控尚不明晰。特别是盐浓度、低温和淹水等逆境如何调控甜菜素合成途径相关酶的合成、活性以及相关基因表达,从而产生不同表型尚无研究。本实验克隆了盐地碱蓬合成甜菜红素的关键酶之一——4, 5-多巴双加氧酶基因(SsDODA)的启动子,通过研究启动子的功能和SsDODA的表达特点,为研究甜菜红素在盐生植物进化和生态适应等方面的作用机理奠定了基础。主要研究结果如下:1. SsDODA启动子的克隆及功能分析使用TAIL-PCR法首次成功地从盐地碱蓬基因组中克隆了4, 5-多巴双加氧酶基因SsDODA的启动子片段。经BLAST比对后发现所克隆启动子3,与SsDODA 5,具有98%的同源性,确定序列为盐地碱蓬SsDODA基因启动子序列。使用Plant CARE和PLACE数据库对1219 bp的SsDODA启动子片段进行顺式作用元件分析,结果表明启动子序列中除了TATA-motif、CAAT-motif等典型的真核生物顺式调控元件外,还含有其他重要的顺式调控元件如光反应元件:GA-motif; GATA-motif; GT1-motif等和低温响应元件LTR等。为了验证SsDODA启动子中各调控元件的功能分别构建了相应的启动子5,缺失植物表达载体。将Pst I和BamH I酶切的各启动子片段和pCAMBIA 1391载体连接,构建了6个不同长度的启动子表达载体。连接产物经PCR以及酶切鉴定确定为重组质粒,且外源片段方向正确,分别命名为全、GA、GATA、GT1、LTR、SP1。通过电转化法将不同长度启动子-GUS瞬时表达载体转化根癌农杆菌GV3101,阳性克隆转化烟草,GUS组织化学检测结果表明,盐地碱蓬不同长度的SsDODA启动子片段均能够驱动报告基因GUS在烟草叶片中表达,证明克隆得到的不同长度的SsDODA启动子片段均具有启动子活性。为了进一步验证SsDODA的启动子中各元件的功能,用含有不同长度启动片段的根癌农杆菌侵染拟南芥,T1代植株GUS组织化学检测结果表明:GUS基因在拟南芥根、茎、叶中均有表达。2.盐地碱蓬SsDODA的表达分析为了研究环境对SsDODA表达及其与甜菜红素含量之间的关系,探讨了黑暗、光照和低温下盐地碱蓬不同器官SsDODA表达及其甜菜红素含量。将盐地碱蓬种子播种于装有干净细沙的塑料盆中,置于培养箱中黑暗培养。3 d后取材将盐地碱蓬子叶、胚轴、胚根分开,进行甜菜红素含量的测定及SsDODA Real-time PCR。结果表明黑暗培养3 d的盐地碱蓬地上部分的甜菜红素含量显著高于地下部分,然而SsDODA在地下部分胚根中的表达量显著高于子叶和胚轴。将盐地碱蓬种子播种于装有干净细沙的塑料盆中,置于培养箱中黑暗培养。三天后转入光下培养,光照时间14 h,光照强度为200μmol/m2·s。分别于黑暗培养3 d、转入光下2 d、转入光下10 d,取地上部分进行甜菜红素含量的测定及SsDODA Real-time PCR。结果表明暗培养三天的盐地碱蓬转光下2 d后地上部分的甜菜红素含量显著升高,转光下10 d后的盐地碱蓬甜菜红素含量显著下降。SsDODA的表达量也呈现先升高后下降的趋势。将盐地碱蓬种子播种于装有干净细沙的塑料盆中,置于培养箱中培养。30 d后转入低温培养,温度:10℃/6℃(白天/晚上),7 d后转入正常条件下恢复培养7 d。分别于正常培养30 d(CK)、低温培养7 d、恢复培养7 d,取地上部分进行甜菜红素含量的测定及SsDODA Real-time PCR。结果表明低温处理7 d后盐地碱蓬地上部分的甜菜红素含量显著升高.转入正常后盐地碱蓬甜菜红素含量显著下降。同时SsDODA的表达量也呈现先升高后下降的趋势。