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芽孢杆菌在工业与食品、人类的健康与疾病及农业生物病虫害防治等领域有重要的应用。枯草芽孢杆菌是好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性非致病菌,但对血红细胞具有一定的溶血活性,这一现象对该菌在医药、食品工业中的应用具有重要的影响。迄今为止,国内外对枯草芽孢杆菌溶血性研究相对较少,对其溶血机理仍不清楚,本研究先后采用基因敲除、转座子随机插入,对一株野生型芽孢杆菌BS224的溶血性进行了改造及分子机理初步分析和探讨。 芽孢杆菌BS224是分离自健康人的皮肤的一株可以治疗烧烫伤的枯草芽孢杆菌,但是由于它具有一定溶血性而限制了其在医药中的应用。与实验室模式菌株168相比,该野生菌株存在遗传转化效率低、难度大等问题。通过联合细胞壁弱化与暂时的失活菌的限制修饰系统,优化了传统的电转化条件,成功实现了对该野生菌的遗传操作,实现了该菌基因的定点敲除及转座子突变文库构建。 根据已有文献报道,在枯草芽孢杆菌或相近菌株中,推测以下8个基因yhdP,yhdT,yrkA,yqxC,yplQ,yugS,yqhB,和ytjA可能与该菌溶血相关,通过对该菌这8个基因敲除及敲除菌株的溶血活性的分析,发现这8个单基因的敲除株的溶血活性与原始菌株相比没有明显的变化。因此,判断这8个基因可能与溶血没有直接相关性。 采用转座子随机突变技术,构建了一个以mariner为基础的菌BS224转座子随机插入突变库。利用高通量的溶血筛选平台,筛选了约20,000突变子。获得了三株溶血性明显降低的突变株,通过生理生化鉴定,发现其中一株突变株BS224Mu1的溶血活力与原始菌株相比下降了约70%,同时该突变株其它性状与原始菌株完全相符。通过对该突变株的转座子插入位点侧翼序列和拷贝数的分析,结果表明这个突变株有一个且仅有一个转座子元件插入到了基因spoVG的编码框。通过对spo VG基因失活突变株在异位引入一个拷贝的有功能的spo VG等位基因,构建该突变株spo VG基因回复突变株,通过溶血检测发现spo VG基因回复能够使得该突变株的溶血活性得到完全恢复,结果表明spo VG基因对枯草芽孢杆菌溶血活性具有重要影响,这在国内外尚无报道。为进一步证实spo VG基因对枯草芽孢杆菌溶血性影响,又在枯草芽孢杆菌模式菌168中也构建了spo VG敲除突变株,通过溶血检测发现spo VG基因的敲除确实能够明显降低枯草芽孢杆菌模式菌株168溶血活性,回复突变实验也证明spo VG基因与枯草芽孢杆菌溶血活性密切相关;可以推断SpoVG参与或调控了枯草芽孢杆菌的溶血特性。另外,也观察到spoVG突变株的芽孢形成的表型与相关报道研究结果一致。溶血过程与芽孢形成过程是否具有相关性,需要进一步的实验来证明。