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研究背景：人IL4是一种外分泌糖蛋白,具有抗肿瘤、抗炎作用,在某些炎症和自身免疫病中具有潜在的应用价值,可能成为防治自身免疫性糖尿病的药物。但是,应用单剂量的IL4有发热、恶心呕吐、鼻充血、腹泻、厌食、体重增加和呼吸困难等副反应。I期临床试验表明静脉注射最大耐受剂量的IL4,并未观察到治疗作用,单独使用IL4没有明显的抗肿瘤作用,而合用其他制剂可见肺转移肿瘤明显转归。之前的研究几乎是基于原核细胞表达系统来源的重组IL4,没有经过翻译后糖基化修饰,这是否是造成IL4临床治疗受限的原因呢?近几年来,重组蛋白技术及其临床应用受到广泛关注,真核细胞表达系统如毕赤酵母能够成功表达分泌糖基化修饰的人源性重组蛋白,但是,糖基化对蛋白质本身生物学活性与功能的影响是怎么的呢,目前在学术界尚无定论。重组人源性IL4在毕赤酵母中表达及其糖基化与生物学功能是否有直接关系,每个糖基化位点的贡献是否一致,在国内至今尚无有关这方面的研究。本课题旨在研究重组人来源的糖基化蛋白在毕赤酵母真核细胞表达系统中的表达及糖基化与其生物学功能的关系。研究目的：旨在研究毕赤酵母真核细胞表达系统中人来源IL4糖基化蛋白的表达,明确糖基化对其蛋白的生物学功能的影响,为重组蛋白在临床疾病治疗中的应用提供新的理论依据。研究方法：用PCR方法扩增人全长IL4cDNA,PCR产物回收,DNA序列分析后克隆至酵母表达质粒pPICZaA(Invitrogen,USA)Xho1/Xbal位点,pPICZa-IL4并转染E.coli(TOP1OF,strain),表达质粒构建成功后,将SacI酶切的线性质粒用酵母转染试剂盒(Pichia Easycom Transformation Kit, Invitrogen, USA)转染毕赤酵母X-33细胞,表达,纯化,-80度保存。SDS-PAGE和western blotting分别检测IL4表达情况。N-glycanase (PNGase F, New England BioLabs)处理IL4,并用点突变法分别突变人源性IL4糖基化位点Asn38和Asn105位,制备质粒并转染毕赤酵母细胞,表达,纯化,-80度保存,分别用SDS-PAGE和western blotting检测IL4糖基化情况,并用质谱进一步证实Asn105位糖基化情况。提取的C57BL/6鼠脾细胞,磁珠分选,收集CD19+脾细胞,分为糖基化IL4组和去糖基化IL4组,用重组人源性IL4处理,37度共孵育16小时后流式检测CD23表达情况。糖基化IL4组和去糖基化IL4组,细胞外分泌IL4和胞内提取IL4分别在4度、室温、37度孵育3天、7天、10天,用western blotting检测。研究结果：人源性糖基化蛋白IL4在真核细胞表达系统毕赤酵母细胞中高表达,并分泌到细胞外培养基中,SDS-PAGE和western blotting结果显示相对分子量约为34-50kDa的IL4分泌量逐渐增多并与96小时后下降。用PNGase F处理后IL4分子量和对照组相比明显减小,约为15kDa。经过纯化后获得高纯度的IL4蛋白。N38A, N105L突变体DNA序列分析结果显示突变正确。western blotting结果显示N38A突变株分泌蛋白分子量明显减小,降至约15kDa,而N105L突变株分泌蛋白分子量无变化,仍为34-50kDa。质谱结果进一步显示N105L突变株分泌蛋白没有发生糖基化。IL4生物活性检测结果显示,糖基化IL4和去糖基化IL4组B细胞CD23表达均上调,但是,和糖基化IL4组相比去糖基化IL4组上调B细胞CD23表达更明显(p<0.01)。蛋白稳定性试验结果显示非糖基化IL4无论细胞内、外均较糖基化IL4稳定,而糖基化IL4组,细胞内外蛋白稳定性相比,外分泌部分较胞内部分更稳定。结论：(1).真核细胞毕赤酵母表达系统,能够成功表达糖基化蛋白rhIL4。(2).Asn38是rhIL4唯一的N-糖基化位点。(3)毕赤酵母表达系统表达的糖基化蛋白rhIL4具有生物学功能。(4).非糖基化rhIL4生物活性和蛋白稳定性更高。