家蚕转基因,条件性RNA干扰技术平台的建立及其应用

来源 :中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 中国科学院上海生命科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:birentx
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科学技术是第一生产力,转基因和条件性RNA干扰技术是生命科学研究中的重要手段。在中国,家蚕是华夏7000年文明的结晶,家蚕属鳞翅目昆虫,以个体较大,取材方便,容易饲养等优点作为良好的模式生物,而家蚕转基因和条件性RNA干扰平台的建立为家蚕品种的改良,家蚕丝腺作为生物反应器生产基因工程蛋白,病虫害的防治及其蚕业的发展提供了可靠的技术支持。 本研究中,通过利用piggyBac转座子来源的载体和编码piggyBac转座酶辅助质粒建立了高效稳定的家蚕转基因技术平台,进而利用该平台又发展了热休克诱导和UAS/GAL4双系统介导的条件性RNA干扰方法,并对幼虫蜕皮,蛹的变态进行了深入研究。 1.家蚕转基因。EGFP荧光蛋白基因作为筛选标记,受含有Pax-6结合位点的启动子3xp3控制,并能在家蚕的眼部和神经系统组织中特异性表达。荧光筛选质粒和piggyBac转座酶表达质粒以混合物的形式注射到家蚕受精卵,获G0代蛾子,互相交配后,经EGFP荧光筛选获得稳定转基因家蚕。 2.UAS/GAL4双系统介导的条件性RNA干扰。编码EGFP RNAi或GAL4转录调控因子的DNA序列载体分别与辅助质粒一起注射到家蚕的胚胎,得到激活系与受激活系转基因家蚕。分子生物学分析激活系转基因家蚕显示GAL4存在高水平的表达。荧光检测来源于激活与受激活系成虫交配后得到的后代胚胎,发现EGFP的荧光表达明显下调,而在相应的对照胚胎中没有变化。 3.热诱导条件性RNA干扰蜕壳激素(Eclosion Hormone EH)的表达导致转基因家蚕羽化缺陷。利用piggyBac介导的转基因技术和果蝇热休克蛋白70基因表达框,在家蚕中建立热休克诱导的条件性RNA干扰方法。选择转基因EGFP和内源性基因蜕壳激素(Eclosion Hormone EH)用于测试RNA干扰的效率和专一性。构建抑制EGFP和EH的RNA干扰的载体,同时制备RNA干扰EGFP和EH的转基因家蚕。42℃热休克诱导之后,专一性的抑制了EGFP和EH的表达。在蛹期,EH基因表达的下调导致蛹一成虫的羽化缺陷,影响依赖于热休克诱导,这种影响是可遗传的,并且这种影响并不存在于受同样条件热休克诱导的野生型和RNA干扰EGFP的转基因家蚕中。 4.条件性RNA干扰抑制蜕皮开启激素(ecdysis-triggering hormone)的表达导致致死的蜕皮缺陷。利用piggyBac介导的转基因技术和果蝇热休克蛋白70基因表达框,UAS/GAL4双系统,在家蚕中条件性RNA干扰ETH基因的表达。二龄幼虫经过42℃热休克处理之后,三龄,四龄幼虫蜕皮行为延期,并导致五龄幼虫蜕皮受阻,最终死亡。激活系和受激活系的后代二龄幼虫蜕皮受阻,导致死亡。
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