肝癌已经成为全球致死率第五的肿瘤，临床上化疗药物治疗效果不佳，容易引起复发和转移。近年来，肿瘤起始细胞的提出为肝癌的治疗提供新的理论基础。肿瘤起始细胞理论认为：肿瘤起源于肿瘤起始细胞，其具有干细胞特性，主要包括自我更新、引起和维持肿瘤生长、多向分化能力和耐药性。本研究分别从分析人肝癌Huh7细胞不同表型的肿瘤起始细胞特性，以及力达霉素对Huh7肝肿瘤起始细胞的作用机制两个方面进行了研究。　　 目的：　　 1、首先证明CD133和EpCAM双表面分子标记组合能更准确地代表Huh7肝肿瘤起始细胞表型。　　 2、进一步研究抗肿瘤抗生素力达霉素对Huh7肿瘤起始细胞的调控作用及分子机制。　　 方法：　　 1、首先，我们运用流式细胞法和westernblot法分析比较了四种肝癌细胞株表面分子标记的表达情况。然后运用流式分选技术，分离出人肝癌Huh7细胞株表型分别为CD133+EpCAM+、CD133-EpCAM+、CD133+EpCAM-和CD133-EpCAM-的四个亚群。在体外，我们对四个亚群细胞进行了肿瘤起始细胞特性的比较：1）运用流式细胞技术检测了血清培养条件下不同亚群细胞的分化能力；2）运用平板和软琼脂克隆形成实验比较了各亚群细胞的自我更新能力；3）运用细胞增殖实验分析了不同亚群细胞对不同化疗药物的耐药情况。另外，对分选后不同亚群细胞进行了肿瘤细胞成球培养，还检测了干细胞相关基因的表达水平。同时在体内，我们运用NOD/SCID小鼠皮下移植瘤实验比较了四个亚群细胞体内成瘤性。我们进一步运用基因芯片技术，比较了CD133+EpCAM+和CD133-EpCAM-亚群细胞microRNA的表达差异，并用定量PCR技术进行了部分的验证。　　 2、体外试验中，我们将未分选的Huh7细胞进行肿瘤细胞成球培养。在有限的连续三代传代中，检测肝癌Huh7细胞球的肿瘤起始细胞特性，包括用流式细胞分析技术检测表面分子标记（CD133和EpCAM）的变化，用real-timePCR方法检测干细胞相关基因的表达水平。在此基础上，我们用力达霉素等不同化疗药物作用于肝癌Huh7细胞球，观察不同化疗药物对细胞成球的影响。同时，用流式细胞分析技术检测力达霉素处理未分选的Huh7细胞后，醛脱氢酶(Aldehydedehydrogenase，ALDH)阳性细胞的比例，还用westernblot法检测细胞表面分子标记(CD133和EpCAM)蛋白水平的变化。接着的体内试验，我们运用裸鼠皮下移植瘤模型检测了力达霉素对肝癌Huh7肿瘤起始细胞的治疗效果。最后，进一步研究其可能的作用机制，用westernblot和T细胞转录因子活性检测的方法，研究了力达霉素对GSK3β/β-catenin通路的活性影响。　　 结果：　　 1、检测结果显示，在四种肝癌细胞株中Huh7细胞的CD133和EpCAM的共表达明显高于其他三种细胞（Bel7402、Bel7404和SMMC7721）。在Huh7细胞中，CD133+EpCAM+亚群细胞与CD133-EpCAM+、CD133+EpCAM-和CD133-EpCAM-其他三个亚群细胞相比，具有更多的肿瘤起始细胞特性。这些特性包括：CD133+EpCAM+亚群细胞具有更强的向其他三个亚群细胞分化的能力；CD133+EpCAM+亚群细胞能形成更多更大的克隆；CD133+EpCAM+亚群细胞中干细胞相关基因的表达水平更高；CD133+EpCAM+亚群细胞对化疗药物表现出更多的耐药性;CD133+EpCAM+亚群细胞在肿瘤细胞球培养实验中能形成更多更致密的肿瘤细胞球；同时,CD133+EpCAM+亚群细胞在体内具有更强的成瘤性和更短的成瘤时间。CD133+EpCAM+与CD133-EpCAM-亚群细胞相比，在microRNA的表达水平上存在明显的差异。　　 2、体外成球实验发现，未分选的Huh7细胞在有限的连续三代传代中，随着肿瘤细胞球传代数的增加，表面分子标记（CD133和EpCAM）的表达和干细胞相关基因的表达水平也明显增加，结果说明有限的连续三代传代的Huh7细胞球部分具有了肿瘤起始细胞的特性。力达霉素能显著的抑制细胞球的形成，减少细胞球的数目和大小，效果明显优于其他几种常用化疗药物（阿霉素和顺铂）。不同浓度力达霉素作用于未分选的Huh7细胞后，能减少肿瘤起始细胞表面分子标记CD133和EpCAM的蛋白表达量，同时也能降低醛脱氢酶阳性的细胞数。体内试验发现，力达霉素能显著缩小肿瘤体积，推迟肿瘤的发生时间。进一步研究显示，力达霉素作用于肿瘤起始细胞的可能分子机制是：无论在体内和体外力达霉素都能显著下调GSK3β/β-catenin通路的活性，主要通过激活GSK3β，抑制β-catenin的活性，减少β-catenin的核转移和降低β-catenin/TCF转录因子的活性。　　 结论：　　 1、CD133+EpCAM+亚群细胞能更准确的代表肝癌Huh7细胞中的肿瘤起始细胞。这也更有利于进一步研究肿瘤起始细胞的生物学机制和进行针对肿瘤起始细胞治疗药物的筛选。　　 2、有限连续传代的Huh7细胞球部分具有肿瘤起始细胞的特性，能在体外部分代表肿瘤起始细胞进行药物筛选。力达霉素能从体外和体内抑制Huh7肝肿瘤起始细胞，并能下调GSK3β/β-catenin通路的活性。这些结果揭示了力达霉素抑制肿瘤起始细胞的可能分子机制，为力达霉素进一步的临床试验提供了有力的支持。