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背景： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是丙型肝炎的病原。其基因突变的频率高，导致HCV的抗原变异性大。目前国内临床大多数丙型肝炎的实验诊断主要依靠检查抗HCV的IgG抗体，但急性期抗体的检出率仅能达到60％(37.6％～82.8％)，部分病例可呈阴性反应，即ELISA法检测HCV抗体有相当部分漏检。HCV RNA是丙型肝炎诊断的重要指标，对HCV感染的诊断、治疗和预后均有重要指导意义。PCR技术自问世以来在医学领域得到广泛的应用，提高了基础医学及临床检验的水平；时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)作为一种高灵敏的定量免疫检测方法，近年来应用范围不断扩大。我们将该技术引入HCV RNA的检测，利用微孔板上的捕捉探针捕捉HCV的RT-PCR的产物，借助于生物素—链霉亲合素(SA)系统以及一种新型螯合物4-4’-(1”，1”，1”，2”，2”，3’，3”□七氟4”，6”己二酮-6”基)-氯磺酰-邻三联苯(BHHCT)使稀土元素铕结合于扩增产物上，利用荧光分析法进行半定量检测。 目的： 利用自行设计的引物、探针和新型铕螯合物BHHCT，建立一种半定量丙型肝炎病毒(HCV)RNA检测方法。并对其反应体系进行优化，观察它的敏感性、特异性、精密度以及回收率。 材料和方法： 1．病例选择：44份阳性病人血清标本均来自本院丙型肝炎患者，经达安基因有限公司HCV检测试剂盒检测确诊，-70℃贮存备用；20份阴性标本均来自体检正常健康人。 2．引物及探针 根据引物设计基本原则，GC％控制在50～60％，Tm值控制在55～60℃，在HCV 5’端非编码区，由Gene runner南京医科大学硕士学位论文软件设计，得上游引物:5’B一GGC GAC AeT eCA eeA TGA ATe3，，下游引物:5’GCA AGC ACC CTA TCA GGC AG3，，产物长度为291bp，即18一3O8bp;捕捉探针:5’NH厂ACC CTA TCA GGC AGT ACC ACAAG，由P r illle pr imer 5.0软件设计。引物和探针均由上海申友公司合成。 3.样本处理用达安基因公司IICV检侧试剂盒提取RNA。具体操作参照试剂盒说明书。 4 .IICV RNA逆转录:配制逆转录反应液20拼l(含5 x RT buffer4禅l、20mmol/L dNTP MixZ协l、10林mol/L下游引物1林l、RNA酶抑制剂2 OU、去核酸酶水n .5拼1、AMV酶10U)。将反应液加至RNA沉淀中，打匀沉淀后瞬时离心，42℃水浴55Inin。 5 .HCv PCR扩增:每个反应管中加入反应液28林1(含10/buffer3似l、Zmmol/L dNTP Mix3林1、25mnlol/L MgCI，3林l、10似mol/L上下游引物各0.5林l、Taq酶IU、DEpC水1 7.8林l)，逆转录产物cDNAZ尽1，总反应体积30尽1，滴加石蜡油封住液面，瞬时离心后置于扩增仪上。按以下条件进行PCR扩增:95℃预变，性sm in:94oC 455，60oC 305，72oC 305，35个循环;72oC延伸7min。扩增结束后，将PCR反应管从扩增仪上取出，以杂交液(2x SSC，1%酪蛋白， 0.02%SDS，0.1%月桂酞基肌氨酸)1:10稀释，沸水浴10min后立即置冰浴中。 6.SA一BHHCT标记:lmgSA溶于6.6ml 0.lmol八NaHCO，中，以lmol八NaOH调pH值至9.1(溶液A):0.smgBHHCT溶于0.Zml无水乙醇(溶液B);将溶液B与溶液A混合，并不停地搅拌1h;用1升0.lmol八NaHCO3(含0.259 NaN3)4oC透析24h。将透析袋取出，换液，再透析7h，于透析袋内的溶液中加入1 omg牛血清白蛋白(BSA)和4mg NaN3，用lmol八HCI调pH值至6.2(保存于一20℃)。标记好的溶液于3 30nlll处测溶液的吸光度。配制好的SA一BHHCT南京医科大学硕士学位论文摩尔浓度计算公式如下:摩尔浓度一吸光度/摩尔消光系数(BHHcT的摩尔消光系数为3.41/1『);将溶液按lml/支分装。取Inll标记液加入与SA一BHHCT等摩尔量EuCI，，以制备sA一BHHCT一Eu3‘鳌合物;用0 .0 smol八Tr 15一HCI(含29/L BSA、19/L NaN3、99/L NaCI，PH 7.8)稀释5倍;56℃加热Zh;分装后一20℃保存。使用时用0 .0 smol八Tr 15一HCI(含29/L BSA、19/L NaN3、99/L NaCI，pH 7.8)稀释1 00倍，立即使用。 7.荧光检测仪器与条件使用美国拍金爱尔默生命科学有限公司vi。to:1420型灸光检测仪进行检测。检测条件为延迟时间0.20ms，窗时间0.40ms，照射率1.00ms;检测板为DNA一Binding微孔板。 8.产物的铸标记检测:包被液(5 ommol/L NaZHpO;，Inunol/L EDTA，pH 8.5)稀释捕捉探针，终浓度为50pmol/100林1，100林l/孔加入到DNA结合微孔板上，4℃过夜。洗液I(PBS，p H 7 .2)洗3次。加入2叨林l/孔封闭液(包被液中加入15 0/0，J、牛血清)，封闭未结合位点，37℃3 onlin后弃封闭液。每孔加入1叨林1 PCR产物变性液，振荡混匀后56℃6Onlin杂交。弃液后，用56℃预温的洗液22(2/SSC，0.2%SDS)洗3次，每次5 6oC，smin。每孔加入100似1 Eu，‘一BHHCT一SA，37oC下孵育60min，以洗液I同上洗涤，置于厚迭纸上拍干。置荧光检测仪上检测荧光值。 9.产物的酶标法检测:步骤同前。每孔加入1 00尽1 SA一HRP(10%小牛血清一PBSI:2 00稀释，pH 7.4)以代替前法的Eu’‘一BHHCT一SA，37℃下孵育3omin。用37oC预温的洗液I洗3次，每次37oC，smino拍干后加入底物A、B各50林1，混匀后置于37℃孵育，1 smin后加入终止液，混匀，读?