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胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶家族的重要成员,是许多生物技术领域的工具酶,在工业生产胰岛素的过程中,胰岛素原的体外激活也需要胰蛋白酶。从动物(猪、牛等)的胰腺中提取的胰蛋白酶由于可能会有一些致病物质的残留,限制了其在食品和药品领域的应用,目前急需重组胰蛋白酶的生产。本文旨在探讨人源胰蛋白酶-1在原核生物中的表达,为其工业化生产及其应用提供研究策略。 本文首先根据Codonusage网站提供的E.coli密码子使用频率表对人源胰蛋白酶-1的核酸序列进行优化设计,将全基因合成的人源trypsin-1核酸序列插入载体pET-39b(+)中凝血酶识别位点编码序列的下游,成功构建了重组载体pET-39b-trypsin-1,并在细菌BL21(DE3)中实现了融合蛋白DsbA-trypsin的大量表达。融合蛋白主要以包涵体的形式存在,通过对包涵体蛋白胞外变性、稀释复性和凝血酶激活操作,获得了有活性的人源trypsin-1。并对培养条件进行了优化,在最优诱导条件:37℃,220rpm,500ml摇瓶装液量为100ml的培养下,以0.5mmol-L-1的诱导浓度,诱导10h后,目的融合蛋白的表达量最高。以市售的猪胰蛋白酶为参照,相当于每升发酵液获得了约1.6mg有活性的胰蛋白酶。为胰蛋白酶的原核表达提供一定的借鉴。 通过重叠延伸PCR将来自载体pET-39b(+)的无信号肽的DsbA中的Cys突变为Ser,并构建了linker-DsbAmut-linker序列。基于载体pET-39b-trypsin-1与pET-28a(+),成功构建了重组质粒p28-Dmut-trypsin。20℃条件下,在工程菌BL21(DE3)中实现了重组质粒p28-Dmut-trypsin的可溶性诱导表达,可溶性重组蛋白约占总表达融合蛋白的40％。通过Ni亲和层析纯化和肠激酶的切割,获得了有活性的人源胰蛋白酶-1。在诱导条件:20℃,220rpm,500ml摇瓶装液量为100ml,0.5mmol-L-1IPTG诱导培养8h后,以市售的猪胰蛋白酶为参照,相当于每升发酵液获得了约1.04mg有活性的胰蛋白酶。本课题解决了人源胰蛋白酶在原核生物中可溶性表达难题,为进一步研究胰蛋白酶在原核生物中的可溶性表达提供了新的思路。