目的糖尿病创伤修复延迟导致难愈性创面、糖尿病足等并发症,是糖尿病患者致死和致残的重要原因。糖尿病难愈性创面致病因素复杂,存在多种细胞功能失调,典型特征包括血管新生减少,炎症消散延迟和基质沉积减少等。托里消毒散出自明代外科学家陈实功的著作《外科正宗》,包涵了中医“托”和“透”的治疗思想。托法(黄芪、当归)流通气血,防止毒邪内陷;透法(白芷、皂角刺)透脓而载毒外泄,是中医治疗“疮疡”的代表性方剂,临床应用取得了良好的疗效。本研究应用糖尿病大鼠皮肤创伤模型观察托里消毒散全方及其拆方托法和透法治疗糖尿病创面的效果,评估其对创面血管生成、炎症消散和基质沉积等方面的影响,明确托里消毒散治疗糖尿病创面的作用靶点;并通过细胞实验进一步探讨托里消毒散中各种中药发挥作用的机制。方法1.应用大剂量STZ单次尾静脉注射SD大鼠诱导糖尿病动物模型,采用背部皮肤打孔制备皮肤创伤模型,随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM组),托法组(DM+TUO组)、透法组(DM+TOU组)、全方组(DM+TT)。在创伤后5天、8天、11天、14天各组分别处死大鼠,取创面组织分析。采用HE染色及Masson染色观察创面组织形态学变化;应用免疫组织化学、q PCR及Western Blotting法从m RNA和蛋白水平观察药物干预对糖尿病创面(1)血管化情况和血管生成相关因子表达的影响;(2)炎症消退情况及炎症因子表达的影响;(3)基质沉积情况及相关调节因子表达的影响。2.以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,应用q PCR、Western Blotting和细胞免疫荧光方法检测四种中药提取物对HUVEC缺氧条件下HIF-1α表达及转录活性的影响。应用CCK-8实验、划痕实验和matrigel实验检测托里消毒散中当归、黄芪、白芷、皂角刺四种中药的乙醇提取物对HUVEC增殖、迁移、成管的影响,并采用主动脉环实验检测四种中药提取物对内皮细胞出芽的作用,评估四种中药提取物的体外促血管生成的能力;应用Western Blotting法检测中药提取物对血管生成关键通路ERK1/2、PI3K/Akt、e NOS/NO信号通路的激活作用,观察ERK1/2、PI3K/Akt、e NOS/NO信号通路抑制剂对药物促血管生成作用的影响。3.以LPS刺激小鼠巨噬细胞(RAW264.7)作为研究炎症反应的细胞模型,应用q PCR、Western Blotting、ELISA法检测透法中的白芷和皂角刺乙醇提取物对高糖条件下LPS活化的巨噬细胞中NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β炎症复合体表达和活化的影响,检测细胞内ROS含量和TXNIP的m RNA和蛋白表达以明确其调节NLRP3炎症复合体的可能机制。结果1.动物造模情况:糖尿病造模后,糖尿病大鼠血糖明显高于正常大鼠,体重明显下降。与NC组相比,DM组大鼠创面愈合明显延迟(P<0.05),出现血管生成减少,炎症细胞消散延迟,成纤维细胞及基质沉积减少等典型糖尿病难愈性创面的病理特征。2.创面愈合率和一般指标:DM组各时间点愈合率均明显低于NC组;托法组愈合率自创伤后6天开始明显高于DM组;透法组愈合率自创伤后8天开始明显高于DM组并在创伤后第10天愈合率超过托法组;全方组愈合率在创伤后第4天开始明显高于DM组,且以后各时间点愈合率均高于拆方组。药物干预期间糖尿病各组大鼠血糖未见明显差异,观察终点(创伤后14天)各药物干预组大鼠体重高于DM组大鼠。3.创面血管生成及相关因子表达情况:与NC组相比,DM组创面内皮细胞标记物CD31和周细胞标记物desmin染色明显减少,VEGF、VEGFR-2、PDGF、PDGFR-β的表达明显降低。托法组、透法组和全方组大鼠创面CD31和desmin染色及VEGF、VEGFR-2、PDGF、PDGFR-β的表达较DM组明显增加,其中全方组好于托法组,托法组好于透法组。创伤后5天,与NC组相比,DM组大鼠创面HIF-1α水平明显减少,托法组和全方组大鼠创面HIF-1α水平较DM组明显升高。4.创面炎症消退、基质沉积及相关因子表达情况:创伤后11天,与NC组相比,DM组大鼠创面巨噬细胞标记物CD68和中性粒细胞标记物MPO免疫组化染色及促炎介质IL-1β、TNF-α及蛋白酶MMP-9表达明显增多,促愈合因子TGF-β1表达明显减少;透法组和全方组创面CD68和MPO染色,IL-1β、TNF-α和MMP-9表达较DM组明显减少,托法组、透法组和全方组TGF-β1表达均较DM组明显增加。创伤后14天,与NC组相比,DM组创面COLⅠ染色明显减少,托法组、透法组和全方组COLⅠ染色较DM组明显增加,全方组高于拆方组,透法组高于托法组。二、细胞实验结果1.当归、黄芪、白芷和皂角刺四种中药提取物对缺氧条件下内皮细胞HIF-1α表达和功能的影响:与低糖组相比,高糖组缺氧条件下HIF-1α的m RNA水平无明显差异,但蛋白表达明显减少,免疫荧光染色显示HIF-1α核转位明显少于低糖组。当归和黄芪提取物可明显增加HIF-1α的m RNA和蛋白水平,还可促进HIF-1α的核转位和转录活性。2.当归、黄芪、白芷和皂角刺四种中药提取物对内皮细胞体外血管生成能力的影响:当归、黄芪、白芷和皂角刺提取物均明显促进内皮细胞增殖,当归、黄芪和白芷提取物还可明显促进内皮细胞迁移和成管,黄芪和白芷提取物明显增加大鼠主动脉环的出芽。黄芪和白芷提取物可激活内皮细胞中的ERK1/2、PI3K/Akt、e NOS/NO信号通路,使用这些信号通路的抑制剂可明显抑制二者的促血管生成活性。3.白芷、皂角刺提取物对巨噬细胞NLRP3炎症复合体的影响:高糖增加巨噬细胞中pro-caspase-1和pro-IL-1β的表达,并增加pro-caspase-1和pro-IL-1β的剪切以及活性IL-1β的释放,葡萄糖浓度对巨噬细胞中NLRP3和ASC的表达水平无明显影响。皂角刺和白芷刺提取物预处理均可明显降低pro-IL-1β的表达水平,白芷提取物预处理还可明显减少pro-caspase-1的表达和剪切、pro-IL-1β的剪切及活性IL-1β的释放。高糖明显增加巨噬细胞中的ROS含量和TXNIP的表达,白芷提取物可减少巨噬细胞中的ROS含量和TXNIP的蛋白水平。结论1、托里消毒散全方及其拆方托法和透法均具有明显改善糖尿病创面愈合的作用。其中,托法在创伤早期作用明显,透法在中后期效果显著,托里消毒散全方效果优于拆方。2.托法改善糖尿病创面的血管生成和血管成熟,其机制与当归和白芷增加HIF-1α的表达和转录功能,上调促血管生成因子的表达有关。3.托里消毒散的四种中药提取物中,黄芪和白芷提取物促血管生成作用明显,与其激活ERK1/2、PI3K/Akt和e NOS/NO信号通路有关。4.透法可促进创面炎症消散,减少炎症因子表达,增加基质沉积。其抗炎作用可能与白芷通过减少ROS的产生和降低TXNIP的表达,抑制糖尿病条件下NLRP3炎症复合体的过度活化进而减少IL-1β的成熟释放有关。