干细胞生物学的研究一直是生命科学领域的热点问题。近年的研究表明,精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)具有多能干细胞的性质。SSC存在于成体睾丸内,它能向子代传递遗传信息,是雄性成体内惟一可复制的二倍体的永生细胞,也是雄性体内唯一的能够将基因信息遗传给下一代的干细胞。　　 原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)以其高分辨率和对细胞的损害小等特性成为细胞膜表面研究的一个十分有利的工具,它不仅可以反映细胞表面的形态特征,而且还能间接定性的研究膜内的一些结构变化,例如细胞骨架的动态行为。　　 SSCs作为精子发生的最原始细胞,到目前为止,其正常的机械性能诸如细胞膜表面的粘弹力、硬度、杨氏模量的大小、粗糙度等各项机械性能均未见报道,本研究首次对其进行了检测,检测结果可以作为判定SSCs的辅助标准之一。　　 本论文以出生后1～5d的雄性长白仔猪为主要研究对象,建立了猪SSCs(Porcine Spermatogonial Stem Cells,PSSCs)的分离、纯化、鉴定和优化培养体系;对PSSCs进行了定向诱导脂肪和肌肉细胞的多能性研究;并且用AFM测定了其正常情况下的细胞机械性能,并与诱导后的细胞进行了机械性能的对比,探讨了不同细胞状态下,其机械性能的改变趋势;最后探讨了PSSCs体外冻存条件的优化,找到了适合PSSCs 体外保存的冻存液组成。主要研究结果如下:　　 1、采用两步酶消化法成功获得睾丸组织单细胞悬液,细胞的活率超过90％,发现三次差异贴壁+淋巴细胞分离纯化法是一种简便有效的SSCs纯化方法,通过细胞涂片鉴定其纯化效率可达到平均93％左右;采用免疫细胞化学方法和AP活性检测SSCs的标志抗原,检测抗原包括OCT4、β1-integrin(CD29)、PGP9.5和AP活性,结果表明培养的细胞特异表达这些SSCs标志抗原;采用RT-PCR.方法检测SSCs的两个标志基因:PGP9.5和OCT4,结果表明在mRNA水平上,培养的细胞特异扩增出目的片断,而用免疫荧光检测蛋白表达时,PSSCs均能被PGP9.5、OCT4和CD29染色,说明相关基因已经在蛋白水平特异上表达了,所以结合使用OCT4、PGP9.5、CD29 和AP染色足以确定所获细胞是否是PSSCs;以DMEM/F12为基础培养基,添加10％FCS,经MC处理的PSTO饲养层细胞为培养条件,采用MTT法结合细胞形态学观察检测SSCs的增殖情况。结果发现,以20ng/ml GDNF和1000U/ml LIF组成的浓度添加到培养基中,PSSCs的体外培养的效果最好,SSCs能在体外维持增殖培养35d,体外传代4次;之后用AP染色和OCT4免疫荧光进行检测,发现形成的克隆团均能被染色,故得出上述培养体系支持了SSCs的体外增殖,培养的细胞仍能维持SSCs的特性。　　 为了提高PSSCs的利用率,为了可以长期连续性研究,我们对PSSCs进行了冻存研究,利用甘油和DMSO作为冷冻保护剂,检测了PSSCs冷冻复苏后的活率和AP百分率,并对最优的组合进行体外培养实验,实验结果如下:经过7d的冻存,解冻后,5％、10％和20％的DMSO为冷冻保护剂的实验组中,其细胞活率分别为59.98±0.7％、80.96±1.77％、14.22±2.66％差异极显著;而5％和10％的甘油为冷冻保护剂的实验组中,3d后的活率分别为7.46±3.87％和29.85±3.49％,虽然二者相比差异极显著,但是,由于其活率非常低,均为超过30％,所以不再进行后续实验。以10％DMSO作为冷冻保护剂,对PSSCs进行冷冻后的复苏实验,发现其AP着色率为82.94±2.44％,并且在复苏36h后可以形成细胞团,其活力得以大部分保留,本实验结果表明冻存PSSCs以10％DMSO+70％DMEM/F12(含1％双抗)+20％FCS为宜。　　 2、为了研究PSSCs的多能性,我们进行了定向诱导分化实验。利用IBMX、胰岛素、地塞米松等联合诱导脂肪细胞,利用5氮杂胞苷和维甲酸联合诱导肌肉细胞。诱导之后,我们对诱导后的细胞进行了检测:发现诱导的脂肪细胞内出现大量脂滴,经过油红O染色发现呈阳性,同时我们做了脂肪细胞相关的标志性基因的分子和蛋白的检测,诸如C/EBPα、PPARγ、LPL、HSL和ATGL等,我们发现一些脂肪细胞特有的标记基因C/EBPα、PPARγ、ATGL在诱导后表达了,同时有些参与脂肪代谢的基因在诱导后的表达量远高于LPL、HSL诱导前,细胞在诱导35d后,出现了细胞形态的改变,由圆形或者椭圆形球状细胞变成了不规则的扁平状贴壁细胞,经过苏木素染色,细胞核清晰可见;对PSSCs进行肌肉细胞的诱导,发现28天后,出现了细胞形态的改变,由圆形或者椭圆形球状细胞变成了长梭状的类肌肉细胞的贴壁形态,对其进行肌肉特有基因DESMIN的免疫组化发现,诱导后的细胞呈阳性,说明PSSCs已经变成肌肉细胞。这说明猪SSCs具有多能性。　　 3、以AFM为技术手段,对正常PSSCs及诱导后的细胞进行细胞机械性能及形貌变化的测定。测定结果表明,正常的PSSCs其粘弹力为47.3±19.7PN,硬度为2.23±0.66mN/m,杨氏模量为3.48±1.45KPa,高度为1.8±O.08μm;诱导脂肪细胞之后,其机械性能改变为粘弹力为64.64±11.44PN,硬度为2.96±0.53mN/m,杨氏模量为1.03±0.18KPa,高度为5.04±0.09μm;诱导肌肉细胞之后,其机械性能改变为粘弹力为219.98±46.02PN,硬度为5.02±1.14 mN/m,杨氏模量为0.244±0.053KPa,高度为3.06±0.12μm;诱导前后细胞机械性能差异显著。说明细胞本身特性改变之后,细胞骨架和结构也随之改变,进而导致细胞的机械性能大幅改变。对正常PSSCs的机械性能的测定目前所知尚属首次,可以作为判定PSSCs的一个辅助性参考标准。可以推进对PSSCs诱导或者分化之后细胞改变的机械性能和基因、蛋白组学相互关系的研究。