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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是危害全球养猪业最严重的疫病之一，该病主要引起妊娠母猪流产、死胎和产木乃伊胎，仔猪呼吸障碍。我国于1996年首次报道此病;2006年爆发由传统毒株变异而引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)流行，该病在各种年龄猪群中的发病率和死亡率都大幅升高，给我国养猪业造成了极大损失。 当前，商业化疫苗的免疫保护力依然存在诸多问题:PRRSV减毒活疫苗(Modified live-PRRSV vaccine，MLV)在一定范围内效果较好，但因为病毒基因组变异频繁而导致疫苗具有很强的毒株特异性，故该疫苗不能对变异流行毒株达到全面的免疫保护;PRRSV灭活疫苗（Inactivated-PRRSV vaccine，Ⅳ）的免疫原性较弱，几乎没有实际应用效果。在病毒感染的早期阶段（感染后7-9d）机体可以检测到强烈的抗PRRSV抗体反应，这些抗体是N蛋白特异的非中和性抗体(Non-neutralizing antibody，Non-NA)，它们不能阻断病毒的感染，相反还与病毒的抗体依赖性增强作用(ADE)密切相关。抗PRRSV中和性抗体(Neutralizing antibody，NA)在阻止病毒感染方面扮演重要角色，然而PRRSV特异性中和性抗体的产生被极大地推迟，它们在感染或免疫后3～4周才可被检测到但效价较低、维持时间较短。同时，PRRSV感染后猪体内的相关细胞因子表达水平起伏不定，其中白细胞介素4(SwIL-4)在感染早期表达量低、几乎难以检测，中后期的表达量和PRRSV特异性IL-4分泌细胞变化频率不大。因此，使动物机体中和性抗体产生时间提前、抗体滴度提高并且维持时间延长，是提高PRRSV疫苗效力的一个重要环节。 本文研究了SwIL-4对PRRSV ORF5核酸疫苗和减毒活疫苗(MLV)诱导机体免疫免疫应答反应与免疫保护的调控作用;同时对PRRSV GP5诱饵性表位A定点突变产生的生物学效应进行了初步探讨。 为初步确定SwIL-4对PRRSV免疫应答的调节作用，本课题首先进行了PRRSVORF5与SwIL-4的核酸疫苗试验。通过基因工程方法克隆表达PRRSV GP5重组蛋白，以此为包被抗原建立检测抗GP5抗体效价的间接酶联免疫吸附方法(iELSIA)，该方法与Western blot检测结果的符合率达93.16％。基因重组获得ORF5与SwIL-4的真核表达质粒，包括pVAX1-ORF5、pVAX1-IL-4、pVAX1-ORF5-IL-4。BALB/c小鼠免疫接种42d后，pVAX1-ORF5+pVAX1-IL-4组外周血抗GP5抗体水平与血清中和效价均显著高于其他三个组(pVAX1-ORF5、pVAX1-ORF5+pVAX1和pVAX1-ORF5-IL-4);56dpi时接种pVAX1-ORF5-IL-4组高于另外两个组，但是显著低于pVAX1-ORF5+pVAX1-IL-4组。小鼠试验显示，真核表达质粒pVAX1-ORF5免疫接种能够诱导小鼠产生抗GP5蛋白的抗体，同时接种SwIL-4在一定程度上增强了机体针对PRRSV GP5的免疫应答反应。两种真核质粒pVAX1-ORF5与pVAX1-IL-4同时分开免疫接种诱导机体产生的免疫应答反应显著高于串联体表达质粒pVAX1-ORF5-IL-4。 本课题进一步研究了SwIL-4在猪体内对PRRSV免疫应答的调控作用，分别进行PRRSV ORF5与SwIL-4核酸疫苗和减毒活疫苗与SwIL-4质粒及对应蛋白质对猪的免疫保护试验。间接ELISA（PRRSV GP2，GP3，GP4，GP5和M蛋白包被）检测猪外周血抗PRRSV膜蛋白抗体效价。猪免疫接种35d后，MLV+pVAX1-IL-4与MLV+Pr.IL-4二组抗PRRSV膜蛋白抗体水平均显著高于另外两个组(MLV，MLV+pVAX1)，而这二组之间无显著性差异;42dpi至21dpc剖检时，接种MLV+pVAX1-IL-4组抗PRRSV膜蛋白抗体效价显著高于其他三个组。需要强调的是，HP-PRRS强毒攻击后所有组的抗体水平皆有下降，但接种MLV+pVAX1-IL-4组猪抗体水平迅速回升甚至高于攻毒前水平，然而其他三个组的抗体则一直处于较低水平未有升高。猪血清中和抗体效价具有与抗PRRSV膜蛋白抗体水平相同的变化趋势。 流式细胞术(FCM)检测猪外周血单个核细胞(PBMCs)中T淋巴细胞亚群百分含量。(1) CD3+CD4+T淋巴细胞亚群含量:42dpi，接种MLV+pVAX1-IL-4与MLV+Pr.IL-4二组CD3+CD4+T淋巴细胞亚群含量开始明显升高，显著高于其他两个组(MLV，MLV+pVAX1)，而该二组之间无显著性差异。63dpi开始，接种MLV+pVAX1-IL-4组CD3+CD4+T淋巴细胞亚群含量出现明显上升，显著高于其他三个组。(2) CD3+CD8+T淋巴细胞亚群含量:免疫接种后至攻毒前，所有组的CD3+CD8+T淋巴细胞亚群含量皆没有明显变化;强毒攻击后MLV+pVAX1-IL-4组CD3+CD8+T淋巴细胞亚群含量大幅下降，显著低于其他三个组。(3)CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群比率:42dpi，接种MLV+pVAX1-IL-4与MLV+Pr.IL-4二组CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群比率开始明显升高，显著高于其他两个组，而该二组之间无显著性差异。强毒攻击后，MLV+pVAX1-IL-4组CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群比率大幅升高，与另三组比较差异极显著。 建立鉴别并定量测定疫苗毒株(TJM-F92)与攻毒毒株（HP-PRRSV SD-JN）的实时定量PCR（RT-qPCR）方法，检测猪外周血PRRS病毒载量。试验数据表明:7dpc，四个疫苗接种组对应外周血病毒载量显著低于PBS对照组;同时，接种MLV+pVAX1-IL-4组显著低于另外三个疫苗接种组。14dpc，五个试验组的外周血病毒载量均出现大幅下降，但四个免疫接种组对应的病毒载量显著低于PBS组，而这四个组之间没有显著性差异。高致病性PRRSV大剂量接种(2.0×1050 TCID50)后，单用MLV免疫接种的猪表现出温和的发烧和食欲不振、嗜睡与被毛粗乱，剖检未见明显的肺脏病变;MLV与SwIL-4同时免疫接种的猪则几乎没有临床症状，也未有肉眼可见的肺脏病变。统计结果显示，SwIL-4添加免疫组临床症状与肺脏病变分数显著低于MLV单独免疫接种组。 以上试验数据显示:试验猪在核酸疫苗或减毒活疫苗与SwIL-4同时免疫接种时，抗GP5或抗膜蛋白抗体水平、血清中和性效价均得到了显著的提高;外周血T淋巴细胞亚群呈现规律性变化，CD4+/CD8+T淋巴细胞百分含量比值显著升高，显示机体的体液免疫应答反应得到极大地增强;外周血PRRS病毒载量(PRRSV loads)显著低于其他免疫组;猪临床症状及剖检肺脏病变均显著低于其他试验组。结果表明，两种疫苗免疫分别在SwIL-4的作用下，试验猪针对PRRSV的免疫应答反应和由此产生的免疫保护力均得到了显著地增强。该研究证明，SwIL-4在PRRSV诱导机体产生“正常”的免疫应答反应方面发挥了极其重要的调控作用。 为进一步研究如何提高机体抗PRRSV中和抗体水平，本课题对PRRSV诱饵性表位(Decoy epitope)A中的N30糖基化位点进行定点突变，以探求该突变对基因转录、蛋白表达以及对机体诱导抗GP5抗体产生的影响。本试验建立了定量测定ORF5基因在细胞内转录mRNA的实时定量PCR方法。检测结果显示，在转染后60h时间内突变体ORF5基因的转录水平始终较低，其对应的mRNA拷贝数小于5×107 log10;而原序列ORF5基因的转录处于高水平，其mRNA拷贝数始终大于1×108 log10，二者差异极显著;此突变使ORF5基因在细胞内的转录水平显著下调。Western blot进行ORF5基因的体外蛋白表达分析，结果发现突变体基因在细胞内翻译表达为两种分子量大小不同的蛋白，其一与原GP5蛋白大小相同，另一条则分子量明显变小。该试验表明，诱饵性表位的定点突变引起了GP5蛋白体外表达的显著变化，推测原因是蛋白的糖基化水平变异导致蛋白分子量改变;抑或糖基化水平变异使该蛋白的空间结构发生改变，从而造成更多的蛋白抗原表位暴露于机体免疫系统。该诱饵性表位定点突变产生的生物学功能变化有待进一步深入研究。 本研究表明，SwIL-4对PRRSV诱导动物的免疫应答反应发挥了极其重要的调控作用;显著增强了猪抗PRRSV体液免疫反应，提高了PRRSV核酸疫苗和MLV对猪的免疫保护力。GP5诱饵性表位糖基化位点定点突变对基因的细胞内转录和体外蛋白表达以及引致细胞死亡（或凋亡）产生显著影响，推测其对应生物学功能可能发生重大变化。