骨内稳态失衡是动物主要的健康问题之一。破骨细胞的分化和活化,在健康动物及患病动物骨重塑中起着至关重要的作用。破骨细胞具有骨吸收活性,由单核细胞巨噬细胞／单核细胞谱系的造血前体细胞融合形成。破骨细胞通过伪足小体,一种特异性的黏附结构,附着在细胞外基质上。伪足小体可形成F-actin环,类似于进行骨吸收的破骨细胞形成的环状封闭带。骨保护素(OPG)和核因子KB受体激活剂(RANK)都是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,通过和RANK配体(RANKL)竞争性地结合,调控破骨细胞形成和功能。RANKL通过激活RANK,促进破骨细胞分化；而OPG连接至RANKL,抑制破骨细胞形成。已有研究发现了OPG作用于破骨细胞分化、融合及黏附的一些重要细节。但这些研究主要集中在编码破骨细胞特异性标志物,潜在的融合因子和黏附相关调控因子基因的表达,通过体外阻断,或过表达方式来研究。因此,OPG抑制破骨细胞分化、融合和黏附的许多重要分子机制仍不明确。本研究以25 ng/mL M-CSF和30 ng/mL RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成的破骨细胞为研究对象,在分化过程中添加不同浓度OPG进行处理,通过形态学鉴定、实时细胞动态分析(RTCA)、免疫印迹法(Western blot)等技术手段,探索OPG对破骨细胞黏附结构和融合的影响,揭示相关调控机制,为进一步阐明OPG对破骨细胞形成及功能的抑制作用提供了理论依据。研究内容如下：1.OPG对不同分化阶段破骨细胞的形成及功能的影响为了研究OPG对不同分化阶段破骨细胞的黏附及活性的影响,本实验采用M-CSF和RANKL处理RAW264.7细胞,培养1、3、5、7 d后,各组分别添加80 ng/mL OPG作用24 h。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和免疫荧光检测破骨细胞分化和黏附能力的变化,RTCA监测细胞生长曲线变化,Western blot检测TRAP、RANK、integrin β3、 matrix metalloproteinase 9 (MMP9)、 cathepsin K、carbonic anhydrase Ⅱ(CA Ⅱ) 及 vesicular-type H+-ATPase A1 (V-ATPase A1)蛋白表达量的变化。结果显示,OPG处理显著增强分化初期细胞(1 d)的存活、增殖及黏附能力,并促进RANK和integrin (β3表达量显著增高(p<0.01)。相反,和对照组相比,OPG抑制成熟的破骨细胞(3-7d)的分化及黏附结构的形成,并显著降低了TRAP、RANK、integrin β3、MMP9、cathepsin K、CA Ⅱ及V- ATPase A1标志性蛋白的表达水平(p<0.01)。说明OPG对于破骨细胞分化不同阶段的生物效应是有差异的,促进破骨细胞前体的黏附和存活,抑制各阶段破骨细胞的分化,并降低分化至中末期的成熟的破骨细胞活性。2.OPG对破骨细胞黏附结构的影响及调控机理为了揭示OPG对破骨细胞黏附结构、黏附相关蛋白表达及分布的影响,本实验采用M-CSF和RANKL处理RAW264.7细胞3d后,在无血清培养条件下,加入不同浓度OPG(0、20、40、80 ng/mL)继续培养24 h,TRAP染色检测不同剂量OPG对破骨细胞分化的影响,扫描电子显微镜(SEM)、RTCA及激光共聚焦技术观察破骨细胞外周黏附结构的动态变化,Western blot检测Pyk2和Src酪氨酸磷酸化水平。结果表明,OPG能够抑制破骨细胞的分化,使细胞黏附结构收缩且呈时间和剂量依赖关系。结合激光共聚焦和Western blot结果发现,OPG导致破骨细胞Pyk2发生去磷酸化,降低了Pyk2在细胞外周黏附结构区域的表达及分布,诱导Tyr 402 Pyk2和Tyr 416 Src向细胞中央聚集,提高了其在细胞中央的表达量,但显著降低了Tyr 527 Src磷酸化水平(p<0.01),增强了Pyk2和Src在破骨细胞中央区域的联系。表明,破骨细胞为了适应OPG的调控,将Src作为衔接蛋白,代偿减少的Pyk2,并与Pyk2一起从破骨细胞外周黏附区域向中心区域转移。说明,OPG通过调控破骨细胞内Pyk2和Src磷酸化及其在细胞内的分布情况,破坏破骨细胞黏附结构。3.OPG调控破骨细胞黏附结构的Ca2+、ERK和p38 MAPK信号通路为了探讨Ca2+和MAPKs信号通路在OPG调控破骨细胞黏附结构中的作用,本实验以细胞内钙离子螫合剂Bapta-AM(5μM),ERK抑制剂U0126(5 μM)和p38抑制剂SB202190(10μM)与OPG (40 ng/mL)联合作用破骨细胞。3h后,TRAP染色、SEM、RTCA、流式细胞术和Western blot分别检测破骨细胞的生成、活力、黏附结构和形态变化,细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i、Pyk2和Src的磷酸化状态。结果表明,OPG抑制了破骨细胞生成和黏附结构的形成,显著降低了[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平(p<0.01),并使Src-pY416磷酸化水平显著增高(p<0.01)。Bapta-AM、U0126和SB202190明显抑制了OPG对破骨细胞分化和黏附结构的作用。Bapta-AM和U0126使降低的[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平恢复至对照组水平,而SB202190没有这种作用。这三种抑制剂都抑制了OPG引起的Src-pY416磷酸化水平升高。说明,OPG通过Ca2+和ERK信号通路破坏破骨细胞黏附结构,激活Src使其作为衔接蛋白补充减少的磷酸化Pyk2,而p38 MAPK信号通路可能在这过程中发挥着不同的作用。4.OPG抑制破骨细胞及其前体融合的调控机理为了揭示OPG对破骨细胞及其前体融合的分子调控机理,本研究利用OPG(40ng/mL)单独或联合ATP (100μM)作用破骨细胞48 h, TRAP染色、RTCA、Western blot和激光共聚焦分别检测破骨细胞及前体细胞的分化、融合率、融合关键因子(CD44、CD47、 DC-STAMP、 ATP6V0D2及Cx43)的表达量和定位变化。结果表明,OPG抑制了多核破骨细胞的形成,与OPG组比较,OPG与ATP联合作用,多核破骨细胞(以细胞核数目分类)数目显著增多(p<0.01)。与对照组比较,OPG仅减少破骨细胞前体CD47的表达量,并使多核的破骨细胞CD44、CD47、DC-STAMP、ATP6V0D2和总Cx43的表达水平显著下降(p<0.01)；与OPG组比较,OPG与ATP联合作用,这些融合相关因子的表达量显著上升(p<0.01)。而OPG降低了破骨细胞及前体细胞中CD44+、CD47+、DC-STAMP+、 ATP6V0D2+、Cx43+细胞在总体的分布比例(p<0.01)。表明OPG通过不同的机制分别调控多核的破骨细胞和单核的前体细胞融合,这些调控机制都可能涉及ATP信号通路。