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目的:1了解河北省肠道病毒71型(EV71)在手足口病(HFMD)实验室诊断病例和重症病例中的感染情况,为进行HFMD的流行病学调查以及预防控制提供科学依据。2分析河北省EV71分离株的基因型别,为采取针对性的控制措施,完善我国EV71的基因型和亚型分类资料,及时监测本地区的EV71流行株以及进行疫苗的研制打下基础。方法:1通过流行病学调查,采集HFMD临床诊断病例的咽拭子、疱疹液、粪便、脑脊液和血清标本。2针对肠道病毒(EV)5′端非编码区保守基因序列以及EV71 VP1区基因序列设计EV通用引物和EV71型特异引物,通过RT-PCR扩增检测HFMD临床诊断病例的标本,琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。3将RT-PCR检测为EV71阳性的HFMD实验室诊断病例标本接种RD细胞分离病毒;选用EV71型特异引物通过RT-PCR对出现细胞病变(CPE)的标本进行毒株鉴定,挑选18株EV71阳性的毒株作为河北省EV71的代表株。4针对EV71的VP1区全核苷酸序列设计引物,用RT-PCR扩增18株EV71代表株的VP1区,纯化回收PCR扩增产物并测定其序列,用DNASTAR软件进行核苷酸序列同源性分析并构建系统发生树,对河北省EV71代表株的基因亚型进行分析。结果:1采用RT-PCR法共检测HFMD临床诊断病例1005份标本,594份标本EV阳性,阳性率为59.1%,293份标本EV71阳性,阳性率为29.2%。其中共检测疱疹液标本138份,59份EV71阳性,阳性检出率为42.8%;粪便标本7份,2份EV71阳性,阳性检出率为28.6%;咽拭子标本840份,232份EV71阳性,阳性检出率为27.6%;脑脊液和血清标本中均未检出EV71。2可以从不同时间采集的HFMD临床诊断病例标本中检出EV71,其采集的时间分布为:从咽拭子标本中检出的时间分布为0-10天,中位数为2天;从疱疹液标本中检出的时间分布为0-11天,中位数为2天;从粪便标本中检出的时间分布为3-5天,中位数为4天。3将RT-PCR检测为EV71阳性的HFMD实验室诊断病例201份标本接种RD细胞进行病毒分离,出现CPE的标本经RT-PCR鉴定,其中74份为EV71阳性,分离率为36.8%。粪便标本接种95份,分离38份,分离率为40.0%;咽拭子标本接种70份,分离19份,分离率为27.1%;疱疹液标本接种31份,分离17份,分离率为54.8%;脑脊液标本接种5份,没有分离出EV71毒株。4 522例HFMD实验室诊断病例中,244例为EV71感染者,感染率为46.7%,其中217例为轻症病例,占EV71感染者的88.9%,具有HFMD的一般表现:发热和皮疹;27例为重症病例,占EV71感染者的11.1%,具有神经系统和呼吸系统的并发症。5 522例HFMD实验室诊断病例中,482例为轻症病例,其中217例为EV71感染者,感染率为45.0 %;40例为重症病例,其中27例为EV71感染者,感染率为67.5%。6在EV71感染者中,男性156例,占EV71感染者的63.9%,女性88例,EV71感染者的36.1%,男性:女性为1.77:1,男性EV71感染率为46.4%,女性EV71感染率为47.3%;EV71感染者中年龄最小为4月,最大为17岁,其中0岁组有1例感染者,占总感染人数的0.4%,1～3岁组167例,占总感染人数的68.4%,4～6岁组65例,占总感染人数的26.7%,7～17岁组11例,占总感染人数的4.5%;在职业分布中,以散居儿童为主,占78.81%,幼托儿童占16.02%,学生占4.83%,其它占0.34%。7河北省18株EV71代表株之间VP1区核苷酸序列同源性为95.2%～100%;与台湾分离株VP1区同源性在88.8%～90%之间,与浙江省、上海市、深圳市、重庆市、北京市和阜阳市分离株VP1区同源性较高,在94.6%～99.4%之间;与A、B基因型代表株VP1区同源性差异较大,分别在81.4%～83.1%、83.8%～85.1%之间,与C基因型代表株VP1区同源性比较接近,在88.1%～98.4%之间;与已知基因型C1、C2、C3、C4代表株的同源性分别在89.5%～91.4%、89.1%～90.2%、88.1%～89%、96.3%～98.4%之间。8 EV71毒株基因分型及系统进化树分析表明,河北省代表株为C4亚型,与中国大陆分离株的流行一致。结论:1 RT-PCR可以直接检测HFMD临床诊断病例的标本,可用于HFMD病原的早期快速诊断。2标本类型不同,EV71的阳性检出率不同,疱疹液标本的EV71阳性检出率高于咽拭子标本的检出率;常规检测中也可用粪便标本来检测EV71病毒;最好采集发病一周之内的疱疹液、咽拭子和粪便标本来检测EV71。3疱疹液、咽拭子和粪便标本均可接种RD细胞分离EV71病毒,疱疹液标本的病毒分离率高于咽拭子标本的分离率。4 EV71病毒是HFMD实验室诊断病例的主要病原之一,能够引起轻症病例和重症病例的发生,以轻症病例为主,而且重症病例的EV71感染率高于轻症病例的EV71感染率。5男性和女性均可感染EV71发生HFMD,EV71的感染率无性别差异;1～3岁组儿童是EV71感染的主要人群,4～6岁组次之,以散居儿童为主。6 EV71毒株基因分型及系统进化树分析表明,河北省代表株为C4亚型,与中国大陆分离株的流行一致。