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关节滑膜组织的过度增生和对软骨的侵蚀是类风湿性关节炎（RA），关节软骨破坏和关节畸形的直接原因。我们前期的研究表明，盘状结构域受体激酶（Discordin Domain Receptor 2, DDR2）在RA 成纤维样滑膜细胞中高表达，并且此受体可以被胶原活化从而增加滑膜细胞MMPs 的表达水平，特别是MMP-13 被认为是RA 关节软骨破坏过程的限速酶，因此我们提出了如下假设：“II 型胶原－DDR2－MMP-13”这样一个环路可能是RA关节软骨破坏的关键环节。为深入探讨DDR2－MMP-13 通路在RA 关节软骨破坏中的作用，我们构建了DDR2 腺病毒表达载体，并建立了稳定检测MMP-13 启动子活性的细胞模型，为验证我们提出的假设并深入研究此通路的关键信号分子奠定基础。
1. DDR2 重组腺病毒的制备我们构建的重组腺病毒系统包括：①携带野生型DDR2 cDNA 的重组腺病毒（Ad-DDR2flag）；②携带组成型活化DDR2 cDNA 的重组腺病毒（Ad-FcDDR2）；③携带DDR2 特异性干涉序列的重组腺病毒（Ad-Si60）；④携带绿色荧光蛋白cDNA 作为对照的重组腺病毒（Ad-EGFP）。本研究使用AdEasy-1 腺病毒系统。首先构建包含目的序列的穿梭质粒（Shuttle plasmid），与腺病毒骨架载体AdEasy-1 在大肠杆菌BJ5183 中进行重组，抽提各重组体质粒，转染HEK293 细胞进行包装，待大部分细胞出现典型的细胞病变（cytopathic effect，CPE）时，低速离心收集细胞并重悬于PBS 中，-70℃/37℃反复冻融、振荡，最后离心收集病毒上清于-70℃保存。采用TCD50 实验测定病毒滴度，应用RT-PCR，Westernblotting 等技术对构建的重组腺病毒鉴定，证明DDR2 相关腺病毒载体构建成功。
2. 稳定检测MMP-13启动子活性细胞系的建立：①MMP13启动子报告基因检测载体的构建：应用PCR扩增得到MMP13启动子序列及荧光报告基因Luciferase 序列，分别连入pcDNA4C 载体并置换出载体原有的CMV启动子。②MMP13 启动子报告基因载体的活性检测：将构建的载体与组成型活化DDR2 质粒瞬时共转染293T 细胞，无血清饥饿过夜DOX 诱导表达DDR2 24h 后，荧光素酶活性分析显示，活化的DDR2 分子能使MMP-13启动子活性增加，证明新的MMP-13 启动子报告基因系统能够被活化型DDR2 激活。③将构建好的MMP13启动子报告基因检测系统转染HEK293细胞，Zeocin 稳定筛选，荧光素酶报告基因检测及PCR 方法鉴定显示，稳定检测MMP-13启动子活性系统建立成功。