目的:心肌肥厚是在各种机械、神经内分泌等刺激增加时心脏的一种代偿性反应。细胞水平主要表现为细胞面积增加,细胞骨架重构以及胎儿基因的再表达。临床研究证实心肌肥厚是心血管事件如心源性猝死等强有力的独立危险因素。因此,研究心肌肥厚的发病机制尤其是分子调控机制对指导心衰的防治具有重要价值,可能发现新的治疗靶点从而改善预后。MicroRNAs（miRNAs）是由17-25个核苷酸组成的内源性非编码RNA,通过和靶基因的3’非翻译区（3’UTR）特异性的结合,从而具有调控靶基因转录后表达的作用。成熟的miRNAs均来源于前体pre-miRNAs的3’端或5’端而被命名为miRNA-3p或者miRNA-5p。众多研究提示miRNAs在心肌肥厚病理中发挥重要调控作用,而特定的miRNA-3p/-5p是否同时参与调控心肌肥厚未有研究。本研究旨在探讨miR-195-3p/-5p在心肌肥厚中的作用及其机制。方法:1.应用Ang II诱导建立H9c2心肌肥大细胞模型,采用Ang II持续输注建立心肌肥厚小鼠模型,继而采用荧光定量PCR的方法检测肥大细胞及组织中miR-195-3p/5p的表达含量,并评估分析细胞肥大模型中细胞面积的改变情况,以及检测肥大细胞及组织中心肌肥厚相关基因的表达情况。2.选取H9c2细胞,利用脂质体转染NC-mimic、NC-inhibitor、miR-195-3p mimics、miR-195-3p inhibitor、miR-195-5p mimics、miR-195-5p inhibitor,之后给予Ang II刺激,利用荧光定量PCR检测心肌肥厚相关基因的表达,利用光学显微镜观察心肌细胞形态,利用image J软件测量细胞表面积。3.利用Targetscan数据库对miR-195-5p的靶基因进行预测,并利用荧光定量PCR的方法在肥大细胞中对可能的靶基因进行筛选。利用脂质体转染miR-195-5p mimics、miR-195-5p inhibitor,采用荧光定量PCR、Western Blot等方法对靶基因的表达量进行验证,同时利用双荧光素酶报告检测系统对miR-195-5p的与靶基因的结合序列进行验证。4.选取H9c2细胞,利用脂质体转染NC-inhibitor、miR-195-5p inhibitor、miR-195-5p inhibitor+siRNA-FBXW、miR-195-5p inhibitor+siRNA-MFN2、之后给予Ang II刺激,利用荧光定量PCR检测心肌肥厚相关基因的表达,利用光学显微镜观察心肌细胞形态,利用image J软件测量细胞表面积。5.选取H9c2细胞,利用脂质体转染NC-inhibitor、miR-195-5p inhibitor、之后给予Ang II刺激,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用Western blot检测Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果:1.用10^-7mol/L、10^-66 mol/L、5*10^-66 mol/L、10^-55 mol/L 4个浓度的Ang II刺激的H9c2细胞48小时,经荧光定量PCR检测发现10^-77 mol/L时心肌肥厚相关基因ANP、BNP表达含量最高,故作为此次实验的干预浓度,利用光学显微镜观察此浓度干预下心肌细胞面积显著增大。在选取的5只小鼠心肌肥厚模型中,大体形态观发现Ang II组小鼠心脏显著肥厚,HW/BW比值较Sham组小鼠显著增加,平均动脉压显著升高,荧光定量PCR检测发现ANP、BNP明显上调,提示模型构建成功。同时采用荧光定量PCR检测miR-195-3p/-5p在肥大细胞及肥大心肌组织中表达量,与对照组相比,miR-195-5p表达增加,miR-195-3p未见差异表达。2.与转染NC-mimic组相比,miR-195-5p mimics加剧Ang II诱导的H9c2细胞中ANP、BNP表达上调,NC-inhitor组中,AngII诱导ANP、BNP表达增加,miR-195-5p inhibitor明显下调ANP、BNP的表达。光镜下观察细胞形态,Ang II组细胞表面积较Control组显著升高,而转染miR-195-5p inhibitor可明显抑制Ang II诱导的心肌细胞表面积增大。与转染NC-mimic组相比,miR-195-3p inhibitor轻度下调了Ang II诱导的H9c2细胞中ANP、BNP表达升高,差异无统计学意义,与转染NC-inhibitor组相比,miR-195-3p inhibitior轻度加剧AngII诱导ANP、BNP表达升高,差异无统计学意义。3.利用Targetscan数据库筛选miR-195-5p作用的靶基因,根据评分共得到9个可能的靶基因:BTG2、SESN1、DYRK2、JARID2、SOX6、FBXW7、TXNIP、LATS2、MFN2。进一步在肥大细胞中对以上可能的靶基因进行表达量检测,结果显示与Control组相比,Ang II诱导组中FBXW7、MFN2表达含量显著降低,BTG2、SESN1表达含量显著升高,由于miRNA作用时靶基因表达含量一般呈负相关,鉴于miR-195-5p心肌肥大时表达显著升高,故选取FBXW7、MFN2做进一步验证。利用荧光定量PCR分析,转染miR-195-5p mimic后,显著下调FBXW7、MFN2的mRNA表达量,而转染miR-195-5p inhibitor后显著上调FBXW7、MFN2的mRNA表达量。Western blot分析FBXW7、MFN2蛋白表达量变化与mRNA表达量变化相同。通过双荧光素酶报告基因系统检测miR-195-5p可以抑制携带野生型FBXW7和MFN2 3’-UTR的萤火虫荧光素酶活性,而不影响携带突变型FBXW7和MFN23’-UTR的萤火虫荧光素酶活性。4.与转染NC-inhibitor组相比,单转染miR-195-5p inhibitior明显下调了Ang II诱导的H9c2细胞中ANP、BNP表达升高,而双转染miR-195-5p inhibitior+siRNA-MFN2或是miR-195-5p inhibitior+siRNA-FBXW7较单转染组ANP、BNP表达含量显著降低。光镜下观察细胞形态,Ang II组细胞表面积较Control组显著升高,而转染miR-195-5p inhibitor可明显抑制Ang II诱导的心肌细胞表面积增大,转染miR-195-5p inhibitior+siRNA-MFN2或是miR-195-5p inhibitior+siRNA-FBXW7可以显著抵消前述改变。5.与Control组相比,Ang II诱导组中促凋亡蛋白Bax及凋亡执行蛋白Caspase-3的表达显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低,而转染miR-195-5p inhibitor可显著抑制Ang II诱导的以上改变。流式细胞检测凋亡率提示与Control组相比,Ang II组凋亡率显著升高,而转染miR-195-5p inhibitor可显著抑制Ang II的促进凋亡效应。结论:1.miR-195-5p在心肌细胞肥厚模型和Ang II诱导的肥厚心肌组织中高表达,提示miR-195-5p在心肌肥厚的病理过程中发挥调控作用。2.miR-195-5p可以加重Ang II诱导的心肌细胞肥大,miR-195-3p在心肌肥厚中的作用仍需进一步阐明。3.miR-195-5p促进心肌肥厚的作用与直接作用于MFN2及FBXW7有关。4.miR-195-5p促进心肌重构的作用还与促进凋亡有关。