番茄细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,Pseudomonas syringae pv. tomato(Pst)为其病原菌,Pst与番茄的互作系统是研究植物抗感病机理的典型模式系统。Pst存在两种无毒基因:AvrPto和AvrPtoB,它们编码的蛋白质均能与番茄抗病基因Pto编码的Ser-Thr蛋白激酶互作,符合Flor“基因对基因”学说。AvrPto和AvrPtoB在表达Pto的抗病植物中,与Pto互作,表现无毒功能,引发植物防御反应;而在缺失Pto的植物中,它们具有毒性,促进细菌的生长。Lescpth5是感病番茄Pto基因家族成员之一,与Pto是同源基因,其编码的蛋白质具有激酶活性,推测其可能与Pto类似,能够与AvrPto、AvrPtoB互作。本文通过Lescpth5表达分析、Lescpth5与AvrPto、AvrPtoB互作分析以及利用酵母双杂交系统在感病番茄中蔬四号中筛选与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,从而初步研究AvrPto和AvrPtoB作为毒性因子的致病机理。研究的目的在于找到AvrPto和AvrPtoB作为毒性因子在感病番茄中蔬四号中的作用靶标。根据Lescpth5基因序列设计引物,成功的利用RT-PCR技术确定了Lescpth5能够表达,同时对该基因从核苷酸和氨基酸水平进行分析,为研究Lescpth5与AvrPto、AvrPtoB的互作提供了基础。PCR扩增得到AvrPto、AvrPtoB以及Lescpth5特异性产物,并将目的基因分别连接到诱饵载体(pGBKT7)和猎物载体(pGADT7)上,成功构建了诱饵载体pGBKT7-AvrPto、pGBKT7-AvrPtoB和pGBKT7-Lescpth5以及猎物载体pGADT7-AvrPto、pGADT7-AvrPtoB和pGADT7-Lescpth5。利用酵母双杂交系统,共转化分析Lescpth5与AvrPto、AvrPtoB的互作关系,结果发现Lescpth5既不能与无毒蛋白AvrPto互作,也不能与AvrPtoB互作。因此推测,Lescpth5不是AvrPto和AvrPtoB作为毒性因子的作用靶标,但是其具体功能还不清楚。成功的构建了感病番茄中蔬四号的cDNA文库,并分别以AvrPto、AvrPtoB作为诱饵蛋白,筛选与其互作的cDNA编码蛋白。最终筛选到与AvrPto互作的阳性克隆19个,将其分为四类;与AvrPtoB互作的阳性克隆11个,将其分为两类。发现与番茄细菌性斑点病菌AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白质主要是参与寄主光合作用的蛋白质,没有筛选到Pto基因家族的任何成员,可见,Pto基因家族成员并不是AvrPto和AvrPtoB作为毒性因子的靶标。本实验围绕AvrPto和AvrPtoB在感病番茄中蔬四号中的作用靶标,证明Lescpth5不能与AvrPto和AvrPtoB互作,同时在酵母双杂交系统中筛选到与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,并发现与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白质主要是参与寄主植物光合作用的蛋白质。推测AvrPto和AvrPtoB作为毒性因子,通过Ⅲ型分泌系统进入植物细胞中,与植物光合作用有关的蛋白互作,或者影响卡尔文循环,或者影响叶绿素和叶绿体内相关蛋白质的合成,从而破坏植物光合作用,促进侵袭位点叶肉细胞衰老、死亡,引起细胞坏死。初步解释Pst无毒基因的致病机理以及感病番茄感病信号转导,为寻找阻断无毒蛋白的作用靶标、控制番茄细菌性斑点病的危害奠定理论基础。