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RNA沉默广泛存在于生物体中,通过阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入,保护生物基因组的完整性；小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance, RMVR)是RNA沉默的一种重要表现形式。在PTGS所引发的RNA降解过程中,因外源基因转录产物与入侵病毒基因同源或部分同源,侵入细胞的病毒基因被RNA降解系统识别并随着外源基因RNA一同被降解。RNA介导的病毒抗性具有高效且持久的病毒抗性,同时其生物安全性也相当稳定。在涉及RNA沉默的相关研究中,siRNA的有效性可能受到靶序列的结构影响。本研究以马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)基因和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)衣壳蛋白(coat protein, CP)基因,马铃薯Y病毒(PVY)的抑制子基因(HC-pro)和黄瓜花叶病毒(CMV)的抑制子基因(2b)为靶序列,构建了不同嵌合基因发卡RNA (hairpin RNA, hpRNA)结构的植物表达载体,转化烟草,进行病毒抗性鉴定,系统性地比较不同嵌合基因结构对RNA介导的病毒抗性的影响；进而以水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)和水稻条纹病毒(Ricestripe virus, RSV)衣壳蛋白基因为靶序列,构建了包含两种病毒CP基因的嵌合基因hpRNA表达载体,转化获得了双抗RSV和RBSDV的水稻新材料。研究的主要结果和结论如下：(1)不同嵌合基因发卡结构和功能基因差异对RNA介导的病毒抗性的影响根据已克隆的PVY CP基因、HC-pro基因和CMV CP基因、2b基因全序列,设计并合成构建嵌合基因单发夹植物表达载体所需引物。通过PCR扩增,获得长度为300bp的各基因3’端cDNA片段,分别插入克隆载体pUC19,获得嵌合基因片段；进一步PCR扩增,获得正向和反向的嵌合基因片段和内含子片段；将扩增的片段酶切,分别连入植物表达载体pROK Ⅱ中,构建了嵌合基因单发夹的hpRNA结构的植物表达载体pDCPSH和pHC2bSH。根据已克隆的PVY CP基因、HC-pro基因和CMV CP基因、2b基因全序列,设计并合成构建嵌合基因双发夹植物表达载体所需引物。通过PCR扩增,获得长度为300bp的各基因3’端cDNA片段和内含子片段；将PVY CP基因和HC-pro基因及内含子片段插入克隆载体pBSK中,获得含PVY CP基因和IC-pro基因的发卡结构cDNA；将CMVCP基因和2b基因及内含子片段插入克隆载体pT-EASY,获得含CMVCP基因和CMV2b基因的发卡结构cDNA；酶切回收两个发卡结构cDNA,连接于植物表达载体pROK Ⅱ中,构建了嵌合基因双发夹的hpRNA结构的植物表达载体pDCPDH和pHC2bDH。将构建的4个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定转基因植株,共得到转pDCPDH, pHC2bDH、 pDCPSH和pHC2bSH的T0代转基因植株各111株、108株、106株和104株。用荧光定量PCR和Northern杂交对目的基因进行转录分析,发现转化嵌合基因双发夹结构载体的转基因植株中目的基因的转录与转化嵌效率和基因单发夹结构载体的转基因植株没有明显差异,但是前者经剪切获得的siRNAs明显多于后者。抗病性分析发现pDCPDH, pHC2bDH、 pDCPSH和pHC2bSH的转基因植株,对PVY和CMV同时表现抗性的植株比例分别为63.25%、37.98%、47.08%和25.78%,转pDCPDH的株系抗病效率为最高,而转pHC2bSH为最低,两者相差近3倍,表明靶向病毒的CP基因双发卡结构具有更好抗病效果。转基因植株的Northern杂交分析发现,转基因在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA积累量明显低于同类型的感病植株,抗病性与RNA积累量呈负相关,证实病毒抗性是由RNA介导的。对转基因植株的siRNA积累量的分析发现植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。转基因植株的Southern杂交结果证明外源基因已整合到烟草基因组中。对T1代的转基因植株的抗病性分析结果发现,几乎所有的低拷贝抗性转基因植株的后代遵循孟德尔遗传分离规律,并且表现很强的抗病毒侵染能力(抗病率均达到95%以上),说明由hpRNA介导的病毒抗性在T1代植株中能够稳定遗传。(2)双抗RBSDV和RSV转基因水稻的培育水稻条纹病毒(RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是目前水稻生产中广泛存在并且危害严重的两种病毒病,培育双抗RBSDV和RSV的水稻品种能够有效降低水稻生产中由病毒病引起的生产损失。以已克隆的RBSDV CP和RSV CP基因全长的cDNA为模板,设计并合成3’端、中间和5’端序列的引物,经PCR扩增获得大小为300bp的正向和反向的片段,通过酶切分别连入植物表达载体pCAMBIA1300UNB中,获得了发卡RNA(hpRNA)结构的瞬时表达载体p1300-RBSDV3’、p1300-RBSDV-M p1300-RBSDV5、p1300-RSV3、p1300-RSV-M和p1300-RSV5’。经瞬时侵染本生烟验证其有效性。Northern杂交显示,6个瞬时表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA,且RBSDV CP基因和RSVCP基因中间序列下调靶基因的表达最为显著。因此,我们选择RBSDV和RSV的CP基因中间序列为靶序列,借助克隆载体pUC19和pBSK,分别构建了嵌合基因单发卡和嵌合基因双发夹的植物表达载体：p1300SH和p1300DH。将构建的2个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌EHA105。利用农杆菌介导的转化方法,转化临稻10号,经除草剂PPT筛选和PCR检测,获得转p1300DH和p1300SH的To代转基因植株各30株和45株。自交结实获得T1代株系,每个载体的T1代转基因株系各选取50棵抗PPT的转基因植株,分别用来自山东济宁的带毒灰飞虱接种RBSDV和RSV,按每株6头,接入2-3d龄带毒灰飞虱若虫(3头若虫携带RBSDV病毒,另3头若虫携带RSV病毒)。病毒抗性的检测结果显示：有8个p1300DH的转基因株系和8个p1300SH的转基因株系,植株的感病率都在6%以下,远远低于转野生型株系的感病率,表现为抗性株系；两个载体其余株系的感病率都在12%以上,表现为中抗和染病株系。统计结果显示,转化p1300SH和p1300DH的转基因株系中抗病株系的比率分别为17.78%和26.67%,表明转化嵌合基因双发卡结构的转基因植株的抗病效率明显高于转化单发卡结构转基因植株。T1代抗性株系的Southern杂交显示,外源基因以不同拷贝数整合于水稻的基因组中；T1代转基因株系的Northern杂交分析表明,抗病性与RNA积累量呈负相关,证明病毒抗性是由RNA介导的；对接种病毒的转基因植株的siRNA积累量分析发现,植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。选取Southern检测呈1-2谱带的T1代抗性植株SH1、 SH15、 SH27、 DH12、 DH14、 DH19、 DH23进行T2代遗传分析。结果表明,转基因及其介导的抗性可以稳定遗传至T2代,并且获得DH14和DH19两个不再发生分离的纯合体株系。