论文部分内容阅读
结直肠癌包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。全球发病率第三,死亡率第二。神经激肽受体包括NK1R、NK2R和NK3R,参与了体内多种生理和病理过程。SR140333是一种高选择性和高特异性的NK1R拮抗剂,我们课题组前期研究发现利用SR140333靶向阻断NK1R能时间和剂量依赖地抑制结肠癌细胞的增殖,并阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导结肠癌细胞发生凋亡,但目前尚未见更深入的分子机制研究报道。在本论文中,我们采用shRNA技术敲降表达NK1R蛋白,发现结肠癌细胞HCT116的增殖被明显抑制,这与用SR140333靶向阻断NK1R的结果相一致。50例结肠癌患者癌组织和癌旁组织的免疫组化结果显示,癌组织中NK1R显著高表达,且其高表达导致结肠癌患者五年生存率显著降低（P=0.004）;免疫印迹检测结果显示与痔疮患者相比,结肠癌细胞系中NK1R也呈显著高表达。SR140333靶向阻断NK1R后c-Myc蛋白的表达显著下调,且过表达c-Myc能显著提高SR140333靶向阻断NK1R后的结肠癌细胞的活力,抵抗细胞周期阻滞和细胞凋亡,提示c-Myc蛋白是SR140333靶向阻断NK1R后抑制结肠癌细胞增殖诱导其凋亡的重要下游蛋白。靶向阻断NK1R也能引起pERK1/2显著下调表达,而与细胞增殖相关的pAKT的表达却发生了显著上调,且只有MEK抑制剂U0126与SR140333联用才能协同地显著抑制HCT116细胞的增殖。U0126单独处理HCT116细胞使pERK1/2与c-Myc均发生了时间依赖的下调表达,且c-Myc下调表达时间明显滞后于pERK1/2,进一步证明了在结肠癌细胞HCT116中pERK1/2直接调控了c-Myc的表达。另外,结肠癌细胞HCT116中蛋白酶体抑制剂MG132能阻断SR140333引起的c-Myc的快速降解。细胞质和线粒体钙流检测结果显示,SR140333靶向阻断NK1R后,细胞质Ca2+浓度呈剂量依赖地显著增加,线粒体Ca2+浓度也适当增加了,而NK1R内源性激动剂SP仅引起了微弱的胞质钙流;胞质Ca2+螯合剂BAPTA和内质网钙库释放阻断剂2-APB均能明显挽救SR140333引起的细胞凋亡,但是线粒体钙通道阻断剂DIDS对SR140333引起的HCT116细胞活力抑制无明显影响,表明SR140333靶向阻断NK1R引起从内质网释放到细胞质的Ca2+浓度快速增加,显著抑制了结肠癌细胞的活力。本研究未检测到SR140333引起细胞质和线粒体ROS的增加。此外,细胞质Ca2+螯合剂BAPTA能显著阻止SR140333引起的pERK1/2和c-Myc蛋白的下调表达,提示SR140333靶向阻断NK1R后,通过胞质Ca2+-pERK1/2-c-Myc信号轴调控了结肠癌细胞的增殖。HCT116荷瘤裸鼠模型的研究结果显示,SR140333显著抑制了荷瘤小鼠肿瘤生长且无明显毒副作用;H&E染色结果和TUNEL染色结果显示在荷瘤小鼠体内SR140333显著抑制了HCT116细胞的增殖并诱导了凋亡;免疫印迹结果发现SR140333在体内也能调控细胞周期和凋亡相关蛋白表达,同时也抑制了pERK1/2和c-Myc的表达,表明在体内外SR140333靶向阻断NK1R后均是通过胞质Ca2+-pERK1/2-c-Myc信号轴抑制了结肠癌细胞的增殖,并诱导了结肠癌细胞发生凋亡。Annexin蛋白超家族是一群由Ca2+调节的磷脂依赖的膜结合蛋白,参与一系列重要的生理病理过程以及肿瘤的发生发展等。Annexin A1对不同肿瘤类型具有不同的作用效果,既可以作为肿瘤抑制因子又可以作为肿瘤促进因子。但目前尚未见Annexin A1在结肠癌上的功能研究。50例结肠癌患者的癌组织和癌旁组织的免疫组化结果显示,癌组织Annexin A1蛋白显著高表达,且高表达患者生存期显著缩短（P=0.005）。对结肠癌细胞HCT116和SW620两种细胞系,我们分别进行了Annexin A1蛋白的敲降表达和过表达,研究结果表明Annexin A1蛋白对结肠癌细胞的增殖有促进作用。流式细胞术结果显示,Annexin A1敲降表达后,结肠癌细胞被阻滞在G0/G1期,而Annexin A1过表达使得结肠癌细胞周期中S期细胞显著增加;但本实验条件下Annexin A1并不明显影响细胞的凋亡和迁移。在荷瘤裸鼠模型中,与Annnexin A1蛋白敲降表达组相比,空载对照组成瘤率高且瘤体增长快,而敲降组肿瘤成瘤率低且易消退,说明在动物水平上,Annexin A1敲降表达会抑制结肠癌细胞的生长。进一步的MTT实验结果显示NK1R拮抗剂SR140333处理Annexin A1敲降和过表达的结肠癌细胞,Annexin A1敲降表达使得结肠癌细胞对SR140333更为敏感。综上所述,本论文研究结果显示NK1R蛋白和Annexin A1蛋白在结肠癌患者中均呈现显著高表达,且与结肠癌患者预后呈显著负相关。靶向阻断NK1R在体内外水平均通过胞质Ca2+-pERK1/2-c-Myc信号轴抑制了结肠癌细胞的增殖,并诱导了结肠癌细胞发生凋亡。Annexin A1蛋白在体内外水平均能促进结肠癌细胞增殖,初步机制研究发现Annexin A1蛋白通过调控细胞周期来促进结肠癌细胞增殖,但不影响结肠癌细胞的凋亡和迁移;且Annnexin A1蛋白敲降表达的结肠癌细胞对NK1R拮抗剂SR140333更为敏感。这些研究结果为开发NK1R和Annexin A1成为结肠癌单独或联合治疗新靶点提供了基础理论数据的支持,为临床结肠癌患者的诊断与治疗带来新的希望和突破。