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随着人们对健康问题的日益重视,减少动物体内过量的脂肪已成为人们普遍关注的问题.过量的脂肪不仅降低了肉的品质,而且不利于人类健康.人体摄入过量的动物性脂肪会导致肥胖症和心脑血管疾病,对人体的健康危害极大.因此,研究人员一直在探索降低动物体脂的有效方法.其中研制和应用抗猪脂肪细胞膜抗体是一个重要手段.可以解决药物残留问题,有益于人类健康.该研究的获取抗猪脂肪细胞膜抗体的轻、重链基因,构建单链抗体基因,利用噬菌体展示技术制备噬菌体抗体,并在大肠杆菌中进行可溶性表达,获得具有对猪脂肪细胞结合活性的表达产物,为以后的进一步应用奠定基础.该研究采用一种新的免疫方法-删减免疫法免疫动物,从经猪脂肪细胞免疫的小鼠脾脏中提取mRNA,以此为模板反转录为cDNA第一链,以小鼠抗体重链可变区VH和轻链可变区VL特异性引物RT-PCR扩增VH、VL基因片段,经重叠引物延伸PCR (SOE-PCR)把VH与VL用编码(Gly4Ser)3连接肽序列的Linker连接成单链抗体ScFv基因,克隆入噬菌粒pCANTAB5E载体,并转化E.coli TG1感受态细胞,在SOBAG平板上筛选转化子,并用M13KO7超感染,获得了抗猪脂肪细胞膜噬菌体抗体文库.经猪脂肪细胞进行三轮淘选后,ELISA筛选检测、酶切鉴定富集后克隆,得到阳性重组噬菌体抗体克隆.用阳性重组噬菌体抗体,感染不含琥珀抑制基因的E.coli HB2151,经IPTG诱导,获得了可溶性表达的抗猪脂肪细胞膜单链抗体.表达产物经ELISA鉴定表明其具有与猪脂肪细胞结合的活性和特异性.SDS-PAGE检测在约30KDa处有一新生条带形成,与预期大小相符.用未经免疫的多种小鼠的脾细胞作为基因来源,提取RNA,反转录为cDNA第一链,以合成的小鼠重、轻可变区基因VH、VL引物,RT-PCR扩增其天然抗体的重链基因VH和轻链基因VL,用含有15肽的Linker引物,对VL基因进行PCR扩增修饰后,然后与VH基因通过重叠延伸拼接反应(SOE-PCR),组装成单链抗体基因(ScFv),克隆入噬菌粒pCANTAB5E载体,并转化E.coli TG1感受态细胞,在SOBAG平板上筛选转化子,并用M13KO7超感染,构建了天然鼠源噬菌体抗体库.经猪脂肪细胞和猪IgG筛选,获得了抗猪脂肪细胞膜ScFv和抗猪IgG ScFv.天然鼠源噬菌体抗体库的构建为筛选和制备各种抗体提供了一个平台.猪脂肪细胞膜重组噬菌体抗体库的构建,为进一步筛选具有高亲和力、高特异性的基因工程抗体打下了良好的基础.抗猪脂肪细胞膜基因工程抗体的研究,为进一步分离和发现这些抗体所识别的猪脂肪细胞表面分子提供了新的工具,可为研究猪脂肪细胞分化机理提供有价值的线索;对减少猪的脂肪含量,提高胴体品质,促进动物生长,具有重要的实际应用价值.