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维甲酸(RA)是脊椎动物体内重要的生理活性物质,在细胞生长、细胞分化、形态发生、免疫功能调节等方面具有广泛的生物学作用。维甲酸在体内经由视黄醇(retinol)氧化成视黄醛(retinal)再氧化成维甲酸两步酶促反应生成,由视黄醇生成视黄醛的反应为限速步骤。 辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NADP(H)-Dependent Retinol Dehydrogenase/Reductase NRDR)是黄东阳教授等从兔肝中发现并纯化的一种酶,具有很高的催化视黄醛(retinal)和视黄醇(retinol)之间氧化还原反应的活性,对体内类视黄醇和维甲酸(RA)的代谢平衡起着重要的调节作用。NRDR不仅对视黄醛具有较强的还原活性,还对其它很多醛酮类物质存在还原活性,所以我们认为 NRDR在体内可能还担负着其他一些重要的生理功能。 维生素K3(menadione)在奈醌环的1,4号位上带有两个酮基团,有着成为NRDR底物的可能。鉴于维生素K3是维生素K1(Phylloquinone)和维生素K2(Menaquinones)前体,在凝血等方面发挥着重要的作用,因此,有必要对NRDR潜在的生理功能及其对维生素K3可能的还原活性进行进一步的研究。 本研究首先构建含兔NRDR全长序列的表达载体,并转化到BL21-AI菌株中进行诱导表达4h。经超声裂解,离心后得到细菌裂解上清液,再通过金属离子亲和层析得到纯化蛋白,经过酶活性分析及SDS-PAGE分析证实得到该纯化酶蛋白为氨基端含6×His标签的兔NRDR重组蛋白。利用该纯化的重组兔NRDR酶蛋白对多种可能的底物进行活性分析,包括9,10-菲醌、维生素BB6、前列腺素E2,结果发现兔NRDR存在维生素K3(menadione)还原活性。通过化学合成、高效液相色谱分析、荧光光谱扫描等方法对维生素K3的还原产物进行鉴定,证实兔NRDR能还原维生素K3生成维生素K4(menadiol),并在含有十二烷基磺酸钠(SDS)及去除氧气条件下,利用高效液相色谱(HPLC)对其进行酶动力学分析,测得其Km值和Vmax分别为30.70μmol和9.091μmol/(min·mg)。本研究提示参与维生素K类的代谢可能是NRDR的另一重要生理功能。