家蚕(Bombyx mori)是重要的鳞翅目模式昆虫,家蚕基因组测序工作在2003年10月即已完成,并于2008年8月完成家蚕bHLH家族成员的鉴定。家蚕有52个bHLH基因,系统进化分析把它们分成39个家族,六个组。然而,有关家蚕bHLH基因及其功能的研究报道还不多。迄今为止,只有ASCa家族的4个成员和AP4家族、Bmal家族、Trh家族各有1个成员的基因得到克隆,并检测了它们在家蚕不同组织中的表达情况。　　 Twist基因属于bHLH转录因子的Twist家族,最早于1983年在果蝇中被发现,它的突变可导致果蝇胚胎发育过程中的“Twisted”表型(扭曲表型)。随后在水蛭、文昌鱼、秀丽隐杆线虫、非洲蟾蜍、小鼠以及人类中相继发现了该基因,然而关于家蚕Twist基因的研究仍未见报道。　　 本文利用生物信息学和实验方法得到了家蚕bHLH转录因子基因Twist,并对其进行了分析和鉴定,为进一步研究Twist的功能积累了一些基础信息资料。生物信息学分析表明,家蚕Twist基因全长1723bp,包括71bp的5’-UTR,854 bp的3-UTR,798 bp的开放阅读框(ORF),编码266个氨基酸,预计相对分子质量为29 kDa。从获得的基因结构来看,该基因在编码区内没有内含子,有转录起始位点和poly(A)加尾信号,编码区内存在一个保守的功能结构域bHLH基序,位于cDNA的No.561-No.716。多序列比对分析发现,BmTwist的氨基酸序列和其他物种在bHLH基序区有较高保守性。系统发生分析结果表明,家蚕Twist序列与豌豆蚜虫的Twist序列形成单进化枝。根据cDNA序列信息,设计引物扩增出家蚕Twist编码序列,利用pGEX-4T-2表达系统在大肠杆菌Rosetta中进行了表达,得到了分子量约55kDa的融合蛋白,Western blotting鉴定正确。蛋白经GlutathioneSepharose4B柱纯化系统纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗家蚕Twist蛋白的血清。RT-PCR对家蚕不同发育阶段和组织检测结果表明,Twist在家蚕各个发育阶段和幼虫不同组织都有表达,其中丝腺及五龄幼虫的表达量相对显著。提取五龄幼虫各组织蛋白进行Westernblotting分析,结果证实Twist在各组织均有表达。细胞免疫荧光显示家蚕Twist蛋白主要定位在细胞质中,细胞核中也有少量表达。利用家蚕杆状病毒表达系统,在家蚕BmN细胞系中成功过表达了重组的Twist蛋白,Western blotting鉴定条带与预测大小一致,约为29kDa,未重组的Twist蛋白表达量明显降低。