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在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌的发病率位居第三位，因其发病隐匿，大部分患者在确诊时即已发生转移，即使实施根治性手术、放疗及铂类为主的化疗等综合治疗，其复发率仍高达50%80%，5年存活率仅为25%30%。近年，基因治疗成为肿瘤治疗的研究热点，尤其是RNA干扰技术的出现和发展，及RNA干扰药物的临床研制，使卵巢癌的基因治疗成为可能。转移和侵袭是卵巢癌最重要的生物学特点。细胞的迁移是由伪足的形成并与基质的粘附而启动的，人们研究发现小G蛋白Rho GTPases超家族尤其是Rac1和Cdc42参与了此过程的调控，进而影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。本文以Rac1为靶向，研究其基因沉默及上调对卵巢癌细胞Skov3侵袭能力的影响并对其机制进行探讨，以期为卵巢癌治疗探索新的治疗方法。目的构建Rac1RNA干扰载体和表达载体，观察其对卵巢癌细胞Skov3迁移侵袭的影响，并初步探讨其机制，为卵巢癌治疗探索新的治疗途径。方法根据Rac1在GenBank登录号NM006908及shRNA设计原则，设计4条以Rac1为靶点的shRNA寡核苷酸；设计扩增Rac1CDS区基因的引物；应用基因重组技术构建含有报告基因GFP的Rac1RNA干扰载体，应用TA克隆构建Rac1的TA重组载体。应用限制性内切酶BamHⅠ或BbsⅠ单酶切鉴定Rac1RNA干扰载体，BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定Rac1TA克隆的重组载体；测序检测阳性重组载体的克隆基因序列，分析序列的正确性。以脂质体Lipofectamine2000介导转染人卵巢癌细胞Skov3，48h后荧光显微镜下初步判断转染效率，流式检测转染效率，RT-PCR和免疫组化筛选、鉴定有效的RNA干扰载体和表达载体。将有效的Rac1RNA干扰载体和Rac1表达载体分别转染Skov3细胞后，激光共聚焦显微镜下观察Rac1沉默和上调对Skov3细胞迁移和侵袭能力的影响，扫面电镜观察转染细胞超微结构的变化。应用RT-PCR检测Rac1信号转导通路上的MMP2、TIMP2、IRSp53、WAVE1、WAVE2和Arp2/3变异体15等相关信号分子mRNA的表达量。主要结果如下：1．应用限制性内切酶BamHⅠ或BbsⅠ单酶切Rac1RNA干扰载体、BamHⅠ和HindⅢ双酶切Rac1TA克隆的重组载体，琼脂糖凝胶电泳显示克隆的DNA片段大小与理论预算值相符；对选取的阳性重组载体进行测序分析，所克隆的4个Rac1RNA干扰载体的寡核苷酸序列与理论序列完全一致，TA克隆的Rac1序列与GenBank登陆的序列一致。2．BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定Rac1的重组表达载体pEGFP-C1-Rac1，琼脂糖显示插入片段存在，筛选阳性表达载体进行后续实验。3．Rac1RNA干扰载体转染Skov3细胞株后48h，荧光显微镜下初步观察转染效率，流式细胞仪检测为29.6%。RT-PCR检测Rac1RNA干扰载体转染的Skov3细胞Rac1mRNA的表达，pGPU6/GFP/Rac1-524转染组Rac1mRNA表达量减少；免疫组化检测转染细胞Rac1蛋白的表达，结果显示pGPU6/GFP/Rac1-524转染组Rac1表达量下降。4．荧光显微镜下观察Rac1表达载体pEGFP-C1-Rac1转染的Skov3细胞，初步判断转染效率，流式细胞仪检测为28%。RT-PCR检测结果显示pEGFP-C1-Rac1转染组Rac1mRNA表达量增加；免疫组化检测结果显示，与pEGFP-C1转染组和未转染组比，pEGFP-C1-Rac1转染组Rac1蛋白表达量增加。提示外源Rac1可上调转染细胞Skov3Rac1的表达。5．激光共聚焦显微镜观察、测算及扫描电镜观察，结果显示，在各转染组中，pGPU6/GFP/Rac1-524转染组细胞迁移距离最短，板状伪足消失，侵袭能力下降；与pEGFP-C1转染组和未转染组比，pEGFP-C1-Rac1转染组细胞迁移距离长，板状伪足增长，侵袭能力增强。6．RT-PCR检测pGPU6/GFP/Rac1-524转染Skov3细胞Rac1参加的信号转导通路上的MMP2和TIMP2，IRSp53、WAVE1、WAVE2和Arp2/3变异体15表达量下降，pEGFP-C1-Rac1转染组上述相关信号分子基因表达增加。本研究主要结论如下：1．成功构建含报告基因的4个Rac1RNA干扰载体和Rac1表达载体；并通过荧光显微镜观察、流式细胞术分析，RT-PCR检测mRNA的表达及免疫组织化学技术检测Rac1蛋白表达，筛选出1个有效的Rac1RNA干扰载体；Rac1RNA干扰载体可以有效沉默Rac1基因和蛋白表达，Rac1RNA表达载体可以有效上调Rac1基因和蛋白表达；2．Rac1基因沉默后，扫描电子显微镜下观察可见，Skov3细胞体积明显缩小，呈小圆形，板状伪足和丝状伪足少见或消失；Transwell侵袭实验结果显示细胞迁移距离较短；表明Rac1基因沉默后细胞迁移侵袭能力降低。Rac1基因上调，扫描电子显微镜下观察可见，Skov3细胞体积明显缩小，细胞表面丝状伪足细小，但可见较多、伸展、较长的板状伪足。表明Rac1基因上调后细胞迁移侵袭能力增强；3．Rac1基因沉默可下调MMP2mRNA的表达，上调TIMP2mRNA的表达；反之，上调Rac1基因可减少MMP2mRNA的表达，增加TIMP2mRNA的表达；4．Rac1基因沉默可下调IRSp53、WAVE1、WAVE2和Arp2/3变异体15的表达，反之，上调Rac1基因可增加IRSp53、WAVE1、WAVE2和Arp2/3变异体15的表达；5．Rac1对卵巢癌细胞Skov3迁移与侵袭的影响可能是通过减少MMP2mRNA、增加TIMP2mRNA的表达以及通过Rac1介导的Rac1/IRSp53/WAVE2-Arp2/3细胞信号转导通路实现的。本研究的主要创新点：成功构建并筛选出有效表达Rac1的RNA干扰载体和表达载体；Transwell侵袭实验结果以激光共聚焦显微镜观察细胞迁移距离，代替通过计数进入下室的细胞数量反映细胞的侵袭能力；通过形态与功能相印证的方式证明Rac1基因上调可增强Skov3的迁移侵袭能力，首次从分子水平系统的阐述了Rac1介导的Rac1/IRSp53/WAVE2-Arp2/3细胞信号转导通路，可能是肿瘤侵袭转移的重要通路之一。