目的:研究新工艺金芪降糖片对链脲佐菌素(STZ)损伤大鼠胰岛β细胞的保护作用,并对其作用机制进行初步探讨。　　 方法:本实验总体设计分为三个部分,按实验对象划分为:大体动物实验、原代胰岛β细胞实验与INS-1细胞株实验。　　 1.大体动物实验:取健康雄性SD大鼠48只,体重180±10g,适应性喂养3日后,随机分为6组,每组8只,分别为:正常对照组(C)、模型对照组(S)、新工艺金芪降糖片高、中、低剂量组(H、M、L)和阳性药对照组(G)。其中C、S组按10ml/kg连续30日ig给予蒸馏水;H、M、L组按3.6g生药/kg、1.8g生药/kg和0.9g生药/kg连续30日ig给予新工艺金芪降糖片混悬液;G组按1.5mg/kg连续30日ig给予格列本脲。除C组外,其余各组于给药后第4日至第10日连续7日pi给予2.5mg/kg链脲佐菌素(STZ),对胰岛β细胞进行特异性损伤。C组pi给予5ml/kg的0.9％NaCl作为对照。每3日监测各组动物日均饮水量、体重、血清胰岛素含量及血糖值。于给药第30日处死动物,取胰腺组织标本测量NO、MDA和SOD含量,并制作石蜡切片进行HE染色和免疫组化染色观察组织形态的改变和凋亡相关基因Bcl-2与Bax的蛋白表达。　　 2.原代胰岛β细胞实验:取健康雄性SD大鼠,采用Ficoll400密度梯度离心法分离纯化得到原代胰岛β细胞。适应性培养24h后接种于96孔板,贴壁后取单层培养细胞,随机分为6组,分别为:正常对照组(C)、模型对照组(S)、新工艺金芪降糖片高、中、低剂量组(H、M、L)和阳性药对照组(G)。其中H、M、L组按1mg生药/ml、0.1mg生药/ml和0.01mg生药/ml终浓度给予新工艺金芪降糖片培养基溶液;G组按0.5mg/ml终浓度给予格列本脲培养基溶液。除C组外,其余各组均按0.3mg/ml终浓度向培养基内加入链脲佐菌素(STZ)对胰岛p细胞进行损伤。37℃,5％CO2条件下同步培养24h后,通过胰岛素释放试验与MTT试验检测胰岛素分泌功能与胰岛β细胞生长活力。　　 3.INS-1细胞株实验:①将INS-1细胞接种于96孔板常规培养,待贴壁后同上法分组给药,37℃,5％CO2条件下同步培养,每日换液。于给药后第1,2,3,4,5,6日进行MTT试验检测细胞活力,绘制细胞生长曲线。②用事先铺好玻片的24孔板制作细胞爬片,同法分组给药加以培养,72h后,进行Hoechst33342染色与AO-PI染色,观察细胞凋亡的形态学改变。③同法分组,于100ml培养瓶中按上述所列终浓度加药培养INS-1细胞,72h后收集细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡率。④RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2与Bax的mRNA表达。⑤Western-Blot检测凋亡相关基因Bcl-2与Bax的蛋白表达。　　 结果:　　 1.大体动物实验:①新工艺金芪降糖片高、中剂量组(H、M)在pi给予STZ后,相对于正常对照组(C)日均饮水量逐渐增加(P＜0.05),体重逐渐下降(P＜0.05),但相对于模型对照组(S)变化幅度较轻(P＜0.05),在持续ig给予新工艺金芪降糖片后症状得到控制与改善。②新工艺金芪降糖片高、中剂量组(H、M)在pi给予STZ后,相对于正常对照组(C)血清胰岛素含量逐渐下降(P＜0.05),血糖值逐渐增加(P＜0.05),但与模型对照组(S)比较变化幅度相对较小(P＜0.05),在持续ig给予新工艺金芪降糖片后血清胰岛素含量逐步平稳,血糖值明显下降。③新工艺金芪降糖片高、中剂量组(H、M)胰腺组织NO、MDA水平显著低于模型对照组(S)(P＜0.05),SOD水平显著高于模型对照组(S)(P＜0.05)。④HE染色显示:新工艺金芪降糖片高、中剂量组(H、M)胰岛形态结构相对完整,胰岛β细胞数量较多。⑤免疫组化结果分析显示:新工艺金芪降糖片高剂量组(H)较模型对照组(S)胰岛形态有所改观,Bcl-2和Bax染色积分光密度(IOD)均有明显不同(P＜0.05),Bcl-2蛋白表达较高,Bax蛋白表达较低。　　 2.原代胰岛β细胞实验:①相对于模型对照组(S),新工艺金芪降糖片高剂量组(H)与阳性药对照组(G)24h胰岛素分泌量较高(P＜0.05)。胰岛素释放试验显示:新工艺金芪降糖片高剂量组(H)胰岛素释放指数(IS)明显高于模型对照组(S)(P＜0.05)。②与模型对照组(S)比较,新工艺金芪降糖片高剂量组(H)的细胞活力(A490mm)值较高(P＜0.05)。　　 3.INS-1细胞株实验:①新工艺金芪降糖片高、中剂量组(H、M)细胞增殖作用相对明显,且呈现剂量依赖关系。②Hoechst33342染色与AO-PI染色显示:新工艺金芪降糖片高、中剂量组(H、M)较模型对照组(S)均有不同情况改观,凋亡和坏死细胞数量相对较少。③流式细胞术检测报告显示:新工艺金芪降糖片高、中、低剂量组(H、M、L)凋亡率均低于模型对照组(S)。④RT-PCR结果显示:与模型对照组(S)比较,新工艺金芪降糖片高、中剂量组(H、M)Bcl-2基因mRNA呈现高表达(P＜0.05),Bax基因mRNA表达中,模型对照组(S)较其它各给药组上调作用更加明显(P＜0.05)。⑤Western-Blot结果显示:与模型对照组(S)比较,新工艺金芪降糖片高、中、低剂量组(H、M、L)Bcl-2基因蛋白均呈现高表达(P＜0.05),而只有新工艺金芪降糖片高剂量组(H)Bax基因蛋白表达明显低于模型对照组(S)(P＜0.05)。　　 结论:　　 1.实验证实新工艺金芪降糖片对胰岛β细胞具有一定的保护作用,主要表现在:　　 (1)新工艺金芪降糖片能有效改善STZ损伤大鼠胰岛细胞所导致的饮水量增加与体重减轻等糖尿病症状,作用较格列苯脲更加持久。　　 (2)新工艺金芪降糖片能减少STZ对胰岛细胞分泌功能的破坏,使机体保持一定的血清胰岛素含量,从而有效控制血糖。　　 (3)新工艺金芪降糖片能够抑制胰腺组织中NO等活性氧簇(ROS)的形成,从而减少MDA等脂质过氧化物的产生,同时还可提高SOD水平,更好地清除氧自由基,保护胰岛细胞。　　 (4)新工艺金芪降糖片能保护胰岛正常生理结构,并减轻STZ对大体动物胰岛细胞内Bcl-2基因蛋白表达的下调和Bax基因蛋白表达的上调作用。　　 (5)新工艺金芪降糖片能够增强STZ环境下大鼠原代胰岛细胞的生长活力,保护其胰岛素分泌功能。　　 (6)新工艺金芪降糖片能够促进STZ损伤条件下INS-1胰岛细胞的增殖活动,且呈现剂量依赖关系。　　 (7)新工艺金芪降糖片能够有效抑制STZ诱导的INS-1胰岛细胞凋亡率,减少细胞死亡数量,抑制Bcl-2基因mRNA及蛋白表达的下调和Bax基因mRNA及蛋白表达的上调作用。　　 2.建议与磺脲类等胰岛素促泌药物共同使用,特别是在血糖与血脂调节效果不理想的情况下使用。