研究背景:在临床上中草药应用广泛，有报道中药可引起药物不良反应，其中有些和药物代谢性相互作用有关。药物代谢主要依赖于肝脏细胞微粒体中细胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)同工酶。抑制或诱导药物代谢酶是药物相互作用的主要机制之一，近年来研究发现中草药也可作用于药物代谢酶系统，影响中草药本身及联合用药的代谢。当中草药为诱导剂时，可以加速由该酶代谢的西药失活；当中草药为抑制剂时，可导致由该酶代谢的西药体内蓄积或中毒。同样，研究药物代谢途径，也有利于指导临床用药，假如中草药由CYP450酶的某一同工酶代谢，那么联合使用该同工酶的抑制剂或诱导剂时会使银杏叶在体内蓄积或代谢加快，在联合用药时就应该加以考虑。中草药成分复杂，有些中草药成分还未知，现在已经能通过体内和体外试验来检测中药饮片对CYP450的影响，但对那些有效成分或代谢产物还不能明确的中药，目前还缺乏有效手段研究其在CYP450酶中的代谢。 最近有报道提出运用中草药的体外药效模型和药物代谢模型来研究中药的代谢途径。假如能建立中药的体外药效模型，我们就可以通过中药在体外人肝细胞微粒体或人原代肝细胞(human primary hepatocytes，HPHs)中预孵育来了解中药的体内首过代谢情况，我们可以用化学抑制剂逐个抑制其中的一个CYP450同工酶，然后与中药培养后，测定中药的体外药效学参数是否改变来了解CYP450同工酶是否参与中药内负责该药效的组分的代谢。由此对有效成分或代谢产物不明确的中药可以通过上述方法判别是否由一种或一种以上的CYP450酶同工酶代谢。 血小板活化因子(Platelet activating factor，PAF)是一种具有高生理活性的磷脂，是强效的炎症介质，是通过与细胞膜上的受体结合而发挥效应的，可以引起血小板激活、黏附和聚集。 银杏叶提取物(Ginkgo biloba leaf extract，GBE)是目前世界上最广泛使用的中草药制剂之一，广泛应用于年龄相关的记忆力减退、认知功能障碍和注意力不集中、老年性或血管性痴呆、间歇性跛行等疾病，同时它具有拮抗PAF激活的血小板聚集的作用。 目前GBE及其成分对CYP450酶活性影响的研究较多，但结论不一。在药物代谢酶CYP450酶系中，现已发现至少有53种CYP基因和24个假基因，其中有显著意义的遗传多态性的酶有CYP2D6、CYP2C19、CYP1A2、CYP2E、CYP3A4，这些酶的基因差异影响到酶的作用时，就会影响代谢酶的活性，进而影响药物代谢。CYP450酶同工酶具有种族遗传多态性，高加索人和亚洲人之间CYP450酶代谢活性也存在差异。CYP3A4、CYP1A2是CYP450酶同工酶中重要的亚族，有必要研究GBE对亚洲人肝细胞CYP450酶同工酶CYP3A4、CYP1A2的影响。同时首次研究人肝细胞CYP450同工酶对GBE代谢的影响。研究目的1.研究肝脏药物代谢(CYP450混合功能氧化代谢同工酶系)对GBE药效的影响。 2.评估GBE对CYP450的代谢性相互作用。 研究方法: 第一部分：富含血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)和少含血小板血浆(platelet poorplasma，PPP)的制备：健康献血员3名，2月内未服用过任何药物，当场采集空腹静脉血，用1：10(V/V)3.8％枸橼酸钠抗凝，操作在室温下进行，离心，收集上清液作为PRP，余下的上清液再离心得到PPP。以上制备参考Koch的方法。 血小板聚集功能测定：采用Born比浊法。PRP用移液管置于预先硅化玻璃测试管中，在磁性搅拌器中连续搅拌，离心。在测定PRP血小板聚集前，用PPP调零，PRP调100％。稀释的PAF血为小板聚集诱导剂。在PRP中加入PAF，保持37℃。聚集反应的过程为5min。记录最大聚集百分率。血小板聚集试验控制在3h以内完成。 血小板聚集抑制试验：PRP测定管中分别加入不同浓度GBE，37℃孵育5min，血小板聚集诱导剂为PAF。 HPHs的制备：人肝脏来源于成年男性健康捐献者，蒙古人种，符合中国器官捐献法规，选用供体的艾滋病病毒、乙肝病毒和丙肝病毒标志物测定均为阴性。HPHs制备采用胶原法，用台盼蓝排斥法测定活性肝细胞数量超过70％，分装后于-80℃的冰箱中保存备用。 GBE经HPHs孵育后对PAF诱导的血小板聚集的影响：GBE在37℃HPHs中孵育60min，离心，温度控制在4℃，取上清液在37℃时与PRP孵育5min，然后加入PAF检测血小板聚集率。 CYP450同工酶对GBE药效的影响：HPHs分别与CYP450同工酶CYP1A2(α-萘黄酮)、CYP2B6(奥芬那君)、CYP2E1(4-甲基吡唑)、CYP2C19(奥美拉唑)、CYP3A4(伊曲康唑)特异性抑制剂预孵育15min，GBE加入上述孵育后的HPHs中再孵育60min，温度都设置为37℃。然后在4℃，离心，选取PAF完成血小板聚集试验。第二部分： 人肝微粒体制备：采用差速离心法，检测微粒体蛋白浓度，缓冲液稀释，分装后置于-80℃的冰箱中保存备用。 测定CYP3A4和1A2的活性：人肝微粒体与GBE预孵育后分别测定实验组和对照组CYP 3A4和1A2特异性探针睾酮和非那西丁的代谢产物6β-羟基睾酮和4-羟基非那西丁研究结果： 第一部分： PAF诱导的血小板聚集试验： 在健康男性成人的血PRP中加入PAF后证实PAF能够诱导血小板的聚集，且其凝集效应与PAF的浓度呈依赖性，EC50为98ng/mL。 GBE对PAF激活的血小板聚集抑制试验： GBE对PAF诱导的人PRP的聚集效应具有拮抗作用，其IC50为33μg/mL。 GBE与HPHs孵育前后测定其对PAF诱导的血小板聚集抑制效应的变化； GBE与HPHs孵育后其拮抗PAF的作用比未孵育的GBE(阴性对照组)增加了约30％(p<0.05)。 CYP450同工酶对GBE药效的影响： GBE经与CYP1A2的抑制剂(α-萘黄酮)预孵育的HPHs孵育后其拮抗PAF的作用近似于阴性对照组。抑制肝细胞CYP1A2后，肝细胞的代谢增效作用减弱。GBE经与CYP2E1的抑制剂(α-甲基吡唑)预孵育的HPHs孵育后其拮抗PAF的作用也接近阴性对照组，但结果无统计学意义。同样，抑制肝细胞CYP3A4、2B6、2C19后，肝细胞的代谢增效作用不受影响。 第二部分： GBE对CYP 3A4和CYP1A2的抑制作用： GBE与人肝微粒体共同孵育后CYP 3A4的活性有抑制作用，IC50为123.6μg/mL。 GBE与人肝微粒体共同孵育后CYP1A2的活性有抑制作用，IC50为224.3μg/mL。 结论：(1)GBE中有效组分经肝细胞代谢，其体外药效增加。(2)CYP1A2可能参与了GBE药效组分的代谢，并增强GBE药效组分的拮抗PAF作用。而其它的CYP450同工酶CYP2B6、2C19、3A4和CYP2E1不参与其代谢。(3)联合应用体外药效模型和体外药物代谢模型是研究中药药物代谢途径的一种可供选择的实用而有效方法。(4)在临床血药峰浓度范围内的GBE不会与经CYP450酶3A4、1A2代谢的药物产生明显的相互影响。