前言：　　 脑挫裂伤外周水肿带是脑挫裂伤急性期围绕中心坏死区的水肿非坏死组织带,细胞可发生凋亡,可能导致病情恶化,因此是创伤性脑损伤药物治疗的靶点区。　　 雌激素在缺血性脑损伤和创伤性脑损伤中都发挥神经保护作用。雌激素主要有两种受体,包括雌激素受体α和雌激素受体β。　　 传统上认为雌激素是通过经典的基因组效应起到神经保护作用,也就是雌激素与细胞核雌激素受体相结合继而调控多种靶基因的表达,雌激素可以上调抗凋亡基因Bcl-2,抗凋亡因子存活素,以及脑源性神经生长因子等。　　 最近的研究发现雌激素也能通过细胞核外/细胞膜的雌激素受体介导的快速非经典非基因组效应起到调节细胞功能的作用。17β雌二醇-牛血清白蛋白偶联复合物(E2-BSA)不能够过细胞膜,因此被用来研究雌激素的非基因组效应。在全脑缺血动物模型中雌激素能快速激活海马CA1区ERK1/2和Akt的活性,从而起到神经保护作用,提示雌激素激发的非基因组效应可能在神经保护作用中发挥重要作用。　　 我们以前的研究发现,17β雌二醇通过上调雌激素受体mRNA和蛋白表达以及降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性对创伤性脑损伤后脑挫裂伤外周水肿带的细胞凋亡具有保护作用,表明雌激素调控的基因组效应在雌激素神经保护中发挥作用。　　 因此,我们希望搞清楚雌激素是否能通过调节非基因组的快速信号传导通路在脑挫裂伤外周水肿带中起到神经保护作用,而且希望探讨在脑外伤不同时期雌激素的非基因组和基因组效应所发挥的不同作用及其作用机制。　　 方法：　　 三月龄雌性SD大鼠双侧卵巢切除术后一周,利用改良Feeney自由落体法制作自由落体脑损伤模型,脑损伤前1小时在脑立体定向仪辅助下脑室内注射17β雌二醇(E2)、雌二醇-牛血清白蛋白偶联复合物(E2-BSA)或对照生理盐水,以判断E2及E2-BSA对脑挫裂伤外周水肿带细胞凋亡的保护作用。同时利用雌激素受体抑制剂ICI182,780、MEK/ERK抑制剂PD98059、PI3K,Akt抑制剂LY294002判断雌激素受体、ERK及Akt在雌激素抗凋亡中的作用。　　 主要采用以下实验方法进行相关研究:　　 一、蛋白免疫印迹(Westernblot)实验　　 利用脑挫裂伤外周水肿带脑标本组织检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的裂解,用以评价细胞凋亡;检测ERK及Akt磷酸化水平,判断雌激素保护细胞凋亡的作用。　　 二、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性荧光检测分析　　 利用脑挫裂伤外周水肿带脑标本组织,检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性,作为评价细胞凋亡的指标,分析雌激素的神经保护作用。　　 三、TUNEL分析法　　 利用TUNEL染色法检测各种处理因素及分组情况下脑挫裂伤外周水肿带中细胞凋亡情况。　　 四、实时荧光定量PCR和琼脂凝胶电泳　　 利用实时荧光定量PCR检测在各种处理因素下雌激素受体α和存活素的mRNA表达,判断E-BSA和E2在脑外伤不同时期对二者转录的影响,判断雌激素保护作用的基因组效应,并用琼脂凝胶电泳观察和印证相应条带的变化。　　 五、统计学分析　　 SPSS13.0版统计分析软件用于分析数据。根据数据的性质选取单因素方差分析或Pearson相关系数等分析方法。P值小于0.05视为统计学有差异。　　 结果：　　 一、脑挫裂伤外周水肿带半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3呈时间依赖性活化(裂解)　　 脑挫裂伤外周水肿带半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活呈时间依赖性,而且最早于伤后1小时就可以利用蛋白免疫印迹实验检测到并且从1.5小时开始更明显。　　 二、E2-BSA和E2对脑挫裂伤外周水肿带细胞凋亡保护作用在不同阶段有不同的作用　　 脑损伤前1小时脑室内注射E2或E2-BSA能够抑制脑挫裂伤后1.5和30小时脑挫裂伤外周水肿带细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的裂解(活化)。而且,E2-BSA在伤后早起(1.5小时)对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3激活的抑制作用比E2更明显,而在伤后晚期(30小时)情况则相反,提示E2-BSA和E2在创伤性脑损伤的不同时期对脑挫裂伤外周水肿带的细胞凋亡具有不同的保护作用。三、雌激素受体抑制剂ICI182,780能够阻断E2-BSA和E2对脑　　 挫裂伤外周水肿带细胞凋亡的保护作用　　 ICI182,780能逆转脑外伤不同时期E2-BSA和E2对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化的抑制作用,表明E2-BSA和E2在外伤不同时期对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化的逆转作用是通过雌激素受体介导的。　　 四、E2-BSA和E2在脑外伤不同时期脑挫裂伤外周水肿带中　　 ERK1/2和Akt的激活中具有不同的作用　　 ERK1/2在E2-BSA和E2处理大鼠脑外伤后早期脑挫裂伤外周水肿带被明显激活,而在晚期则被轻度激活。Akt在外伤早期同样被明显激活,而在晚期则不被激活。ERK1/2和Akt在E2-BSA处理外伤组早期比E2组更有效地被激活,证明雌激素的快速非基因组效应参与脑外伤后早期脑挫裂伤外周水肿带的保护作用。　　 五、ICI182,780阻断E2-BSA和E2在脑挫裂伤外周水肿带中对ERK1/2及Akt的激活作用　　 ICI182,780能够明显减弱E2-BSA和E2在脑外伤后早期对ERK1/2和Akt的激活作用,表明E2和E2-BSA通过雌激素受体调节ERK1/2和Akt的活化。　　 六、PD98059和LY294002减弱E2-BSA和E2在脑外伤后早期脑　　 挫裂伤外周水肿带的保护作用　　 PD98059和LY294002预处理能部分阻断脑外伤后早期E2-BSA和E2对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化(裂解)的抑制作用,而在晚期,对于E2-BSA组抑制剂的作用跟早期类似,而对于E2处理组大鼠,两种抑制剂的作用都不明显。这些结果表明ERK1/2和Akt信号传导通路介导雌激素在脑外伤后早期脑挫裂伤外周水肿带中的快速激活作用。　　 七、E2能诱导脑外伤后晚期脑挫裂伤外周水肿带雌激素受体α和存活素的mRNA表达　　 在E2-BSA和E2处理大鼠中,脑挫裂伤外周水肿带中雌激素受体α的mRNA表达在脑外伤后早期不明显。E2处理组大鼠中雌激素受体α的mRNA在脑外伤晚期表达明显升高,而在E2-BSA处理大鼠中表达升高程度则不明显。类似的情况,存活素在E2处理大鼠脑外伤晚期而不是早期mRNA表达明显升高。这些结果表明E2能够在脑外伤后晚期通过基因组效应对脑挫裂伤外周水肿带的细胞凋亡起到保护作用,这一点跟E2-BSA的作用不同。　　 结论：　　 1、雌激素在脑外伤后早期脑挫裂伤外周水肿带中可以通过快速激活ERK和Alt等抑制细胞凋亡,即通过非基因组效应发挥神经保护作用。　　 2、雌激素在脑外伤后晚期脑挫裂伤外周水肿带中可以通过调节雌激素受体α和存活素mRNA表达等抑制细胞凋亡,即通过基因组效应起到神经保护作用。