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从广东省广州市郊及博罗县田间采集表现典型花叶病症状的糖蔗(Saccharuminterspecifichybrids)、果蔗(Saccharumofficinarum)和玉米(Zeamays)叶片,机械摩擦接种玉米无毒实生苗,获得了3个侵染玉米并表现花叶的病毒分离物。根据GenBank数据库已公布的甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)CP基因序列设计(改进)扩增SCMV近全长CP基因的特异引物、以显症玉米病叶总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,这3个病毒分离物均能获得预期大小的扩增产物;对扩增产物直接测序,序列比对分析揭示,3者均与已报道的SCMVCP基因序列具高度的同一性,因此将这3个病毒分离鉴定为SCMV,并分别命名为SCMV糖蔗分离物(sh-gz)、玉米分离物(mz-gz)和果蔗分离物(so-bl)。结合GenBank中已公布的部分相应序列,采用序列比对及分子系统进化树重建方法,对SCMVCP基因序列的变异性进行分析,结果表明:SCMV遗传分化与寄主种类关系密切。SCMV果蔗分离物(so-bl)与已报道的广西南宁、浙江象山、浙江余杭、浙江临平果蔗分离物的CP基因核苷酸同一性较高,分别为99.6%、87.2%、86.9%和86.6%,可归属周国辉等(2006)建立的高贵甘蔗组(noblesugarcanegroup,NSCEgroup);SCMV玉米分离物(mz-gz)与已报道的来源于玉米上的各分离物CP基因核苷酸同一性为81.9%~91.7%,可归属Alegrua等(2003)建立的SCMV玉米组(maizegroup,MZgroup);SCMV糖蔗分离物(sh-gz)与已报道的8个杂种甘蔗分离物高度同源,CP基因核苷酸同一性为96.1%~98.6%,可归属Alegria等(2003)建立的甘蔗组(sugarcanegroup,SCEgroup)。
运用软件DNAStar5.01中的MapDraw程序对已测序的三个分离物CP基因片段序列进行分析,发现MspI和EcoT22I可将三个分离物鉴别开来,并在此基础上建立了SCMV糖蔗分离物(sh-gz)、玉米分离物(mz-gz)和果蔗分离物(so-bl)的RT-PCR-RFLP鉴定技术,为SCMV不同分离物侵染玉米的病理学研究打下了基础。
以RT-PCR-RFLP技术对受侵玉米植株体内SCMV不同分离物进行检测,结果表明,无论是同时还是先后接种,SCMV3个不同寄主来源的分离物均能在玉米植株中两两或三者共存(mz-gz+so-bl除外,可能是接种与检测时间相距太短),揭示不同寄主来源的SCMV分离物能够在玉米体内实现复合侵染。
电子显微镜亚细胞病理学观察表明,玉米受到SCMV糖蔗分离物、玉米分离物单独侵染及复合侵染后细胞超微结构发生了明显的病理学变化。受糖蔗分离物单独侵染后,玉米细胞中叶绿体、线粒体等细胞器受到不同程度的损伤;病毒粒体和内含体数量很少。受玉米分离物单独侵染后,细胞中叶绿体、线粒体等细胞器损伤严重,细胞壁上的胞间连丝数量明显增多,细胞质内有风轮状、片层聚集状、卷筒状、束状内含体以及大量线状病毒粒子;在叶绿体、细胞质中,还可观察到过氧化物酶结晶体;另外,在筛管细胞中还观察到风轮状体、束状体和胞间连丝。受两分离物同时侵染后,玉米细胞中叶绿体、线粒体等细胞器不仅发生变形、局部消解,有的细胞器整个被消解,只剩下膜结构;有的细胞内仅剩下消解碎片和病毒粒子,细胞被严重破坏,细胞壁上的胞间连丝数量增多;在细胞质中也出现了风轮体、片层状聚集体、束状体、卷筒体以及大量病毒粒子;在受两个分离物复合侵染的玉米叶肉细胞中还能观察到过氧化物结晶体,该结晶体分布在叶绿体和细胞质中。
对苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等防御酶活性进行测定,结果表明:SCMV不同寄主来源的分离物单独侵染及混合侵染所引致的玉米叶组织各防御酶活性变化存在着明显的差异。
本研究从分子水平揭示了侵染我国甘蔗及玉米的SCMV遗传多样性,建立了鉴别SCMV不同分离物的RT-PCR-RFLP技术,首次发现并证实SCMV不同寄主来源的分离物能够复合侵染玉米,并从亚细胞水平和生理生化水平丰富了SCMV种下致病力分化研究资料,为甘蔗和玉米花叶病的防治提供了理论依据,为深入开展SCMV分子进化及其与寄主植物互作机制等研究打下了一定的基础。