第一部分新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞原代培养　　目的：　　本部分研究旨在建立新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞的体外原代培养新方法。方法：　　采用出生1～3天的Sprague-Dawley大鼠，显微解剖血管纹和螺旋韧带组织进行体外组织培养，3天后采用选择性胰酶消化法和差数贴壁法进行血管纹缘细胞的分离、培养、纯化。流式细胞仪对培养的细胞进行纯度鉴定。　　结果：　　血管纹和螺旋韧带组织块进行体外培养第3天，倒置相差显微镜下观察发现缘细胞从组织块周围逐渐爬出，细胞为多角形，呈“铺路石”样排列。采用选择性胰酶消化法和差数贴壁法进行血管纹缘细胞分离、培养及纯化后，约第10天可以得到纯度较高的缘细胞，采用CK-18角蛋白抗体标记后经流式细胞仪鉴定，细胞阳性率为85.3%。　　结论：　　采用组织培养结合细胞培养的方法，用选择性胰酶消化法和差数贴壁法进行血管纹缘细胞纯化，可以在10天左右得到纯度较高的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞，可用于进一步的实验研究。　　第二部分新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中ATP囊泡性质的研究　　目的：　　本部分研究旨在观察体外原代培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中存在ATP囊泡，证明此囊泡为溶酶体结构。　　方法：　　采用出生1～3天的Sprague-Dawley大鼠，进行体外血管纹缘细胞的原代培养。喹丫因/LAMP1、喹丫因/溶酶体探针、Mant-ATP/溶酶体探针分别处理缘细胞后，采用激光共聚焦显微镜观察。缘细胞分别用喹丫因、溶酶体探针、线粒体探针染色后各加入200μM甘氨酰-L-苯丙氨酸-?-萘酰胺(glycyl-L-phenylalanine-?-naphthylamide,GPN)或1μM碳酰氰4-（三氟甲氧基）苯腙(p-trifluoromethoxyphenylhydrazone,FCCP)和10μM寡霉素后，激光共聚焦显微镜下观察加药前后染色颗粒荧光强度的变化。透射电镜下观察缘细胞的超微结构和喹丫因染色后的缘细胞结构及喹丫因标记的ATP囊泡。　　结果：　　缘细胞在喹丫因染色后，激光共聚焦显微镜下可见在细胞质中有大量绿色星点状颗粒。而相同方法处理3T3细胞后未在细胞质中发现相同的绿色荧光颗粒。喹丫因与LAMP1的共定位系数平均为89.8%，喹丫因染色的颗粒也可以被溶酶体探针标记，两者的共定位系数平均为91.3%，但不能被线粒体探针标记。Mant-ATP积聚的囊泡也可以被溶酶体探针染色。用喹丫因、溶酶体探针分别处理缘细胞30分钟，在加入200μM GPN后，染色颗粒荧光强度明显减弱；而用线粒体探针处理缘细胞，加入GPN后，染色颗粒荧光强度无明显变化。用喹丫因、溶酶体探针分别处理缘细胞，在加入1μM FCCP和10μM寡霉素后，染色颗粒荧光强度无明显减弱，而用线粒体探针处理缘细胞，加入FCCP和寡霉素后，染色颗粒荧光强度明显减弱。在透射电镜下可以观察到喹丫因标记的溶酶体，但喹丫因不能标记线粒体。通过透射电镜还可以观察到缘细胞中的很多结构，诸如微绒毛、“Ω”样凸起、各种有包膜和无包膜的囊泡、线粒体、溶酶体等等。细胞之间以紧密连接相连。在腔面顶端还发现胞吐现象。　　结论：　　新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中存在 ATP囊泡，在激光共聚焦显微镜和透射电镜下证实了此种囊泡为溶酶体结构，推测其通过溶酶体胞吐作用释放ATP。　　第三部分新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞ATP释放实验　　目的：　　本部分研究旨在探讨体外原代培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞可以释放ATP。　　方法：　　新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞原代培养后，采用不同处理方法，使用化学发光法检测细胞外液中ATP的释放量。3T3细胞作为对照组。每组采用3个平行复孔，每次实验至少重复4次。200μM GPN处理后，分别记录加药前、加药后5分钟、10分钟、15分钟荧光值。采用SPSS20.0进行各组的统计分析。　　结果：　　荧光值和细胞浓度呈线性相关。3T3细胞r12=0.9996,缘细胞r22=0.9997。各种浓度的缘细胞中加入200μM GPN5分钟后，可以测量到荧光值较3T3细胞增加25.7%，两组比较有明显统计学差异，P<0.01。200μM GPN、1%Triton X-100,10μM毒胡萝卜素，200μM GPN+5μM毒胡萝卜素分别处理5分钟后，缘细胞中荧光值显著增加，3T3细胞中荧光值无增加；各组与3T3细胞比较有明显统计学差异，P<0.01。而5μM毒胡萝卜素处理5分钟后再加200μM GPN5分钟后，缘细胞中荧光值无显著增加，与3T3细胞比较无明显统计学差异，P>0.05。　　结论：　　新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞可以释放ATP，且ATP存在于膜包被的溶酶体结构内。　　第四部分新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞ATP释放机制的初步实验　　目的：　　本部分研究旨在初步探讨体外原代培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞释放ATP的机制。　　方法：　　采用出生1～3天的Sprague-Dawley大鼠，进行体外原代血管纹缘细胞的分离、培养、纯化。采用细胞免疫染色步骤，缘细胞分别用AM1-43和LAMP1、AM1-43和EEA1标记后，在激光共聚焦显微镜下观察标记物共定位的情况。缘细胞在2.5μM FM1-43染色后10分钟，加入200μM GPN后2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟观察荧光变化情况。　　结果：　　AM1-43和LAMP1共定位，共定位系数平均为85.7%，而AM1-43和EEA1不共定位。缘细胞在2.5μM FM1-43染色后10分钟，加入200μM GPN后2分钟荧光增强，随后逐渐减弱。　　结论：　　我们证实了新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中存在ATP囊泡，推测其通过钙离子依赖的溶酶体胞吐作用释放ATP。