链霉菌是自然界中一类常见的微生物,可合成多种具备临床应用价值的次级代谢产物,例如抗感染药物、抗生素及抗病毒制剂等,其中具有抗真菌活性的药物主要是多烯类抗生素,例如I型聚酮大环内酯类化合物。多烯类抗真菌抗生素可以与真菌细胞膜的主要成分—麦角固醇特异性结合形成孔道,导致菌株内重要的生命物质流失,无法进行正常的生理活动,最终死亡。随着DNA测序技术的迅猛发展,多种常见链霉菌的全基因组序列已被报道。通过生物信息学分析可知负责抗生素生物合成的基因通常聚集在一起形成生物合成基因簇(BGC),包括结构基因和调控基因。BGC在不同的水平上控制次级代谢,最普遍的控制方式便是簇内外的调控基因形成的调控级联。链霉菌的次级代谢调控系统对抗生素生物合成的调控是非常精密且繁杂的,尤其是对于具有多个调控基因的BGC而言。链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)可以产生多烯类抗生素FR-008,其BGC包含有四个调控基因fscR1、fscR2、fscR3和fscR4,编码四个调控蛋白并形成调控亚簇。这些调控基因的同义排列广泛分布在不同的多烯类抗生素生物合成基因簇中,暗示了此类抗生素生物合成的调控机制存在高度的保守性。但是,他们之间的联系仍是未知的。已有相关文献报道调控基因fscR1和fscR4对多烯抗生素FR-008的生产至关重要。本课题进一步表征了其他两个调控基因fscR2和fscR3的功能,并重点解析了这四个调控基因之间的级联调控网络。本课题首先借助同源重组技术对链霉菌FR-008进行基因缺失操作,构建了△fscR2、△fscR3、△fscR2-3和△fscR1-4四个缺失突变菌株。通过转录分析,生物测定,HPLC分析,证实敲除单个或多个调控基因不会影响链霉菌的生长,然而FR-008生物合成基因簇中基因的表达水平降低,FR-008合成受阻,这表明四个调控基因在FR-008生物合成中都是不可或缺的。本研究借助链霉菌FR-008的荧光实时定量PCR(Realtime-PCR)实验揭示了尽管fscR1-fscR4在整个生长阶段均差异性表达,但显示出相似的时间表达模式,即在早期指数期相对表达量突然激增至最高水平,此结论与生物活性测定实验结果相符。另外,六种缺失菌株(△fscR1、△fscR2、△fscR3、△fscR4、△fscR2-3和△fscR1-4)中FR-008生物合成基因簇的全面Realtime-PCR实验结果表明四个调控基因fscRl fscR4对生物合成基因簇中的结构基因具有不同程度的控制,且具有叠加性。全面的交叉回补实验结果表明,功能性回补仅发生在某些调控基因之间,并且是单向的,即fscR1可功能性回补fscR2和fscR3的缺失,fscR3可功能性回补fscR2的缺失,反之不成立。最终,基于以上交叉回补和转录分析结果解析了存在于调控基因间控制FR-008和其他潜在多烯类抗生素生物合成的层次清晰的级联调控网络。本课题将为未来研究其他生物合成基因簇中多个调控基因的作用及其级联调控网络提供新的方向和见解。综上所述,可知链霉菌FR-008的四个调控基因fscRlfscR4均为途径特异性调控基因,调控多烯类抗生素FR-008的合成且是必需的,但不影响菌体的形态、生长及成熟。四个调控基因在链霉菌生长过程中差异性表达,部分基因间存在功能性回补,对结构基因差异性控制,彼此之间交叉调控,从而形成调控网络的复杂级联。