目的:对临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β-内酰胺酶基因进行序列分析,明确酶基因表型;构建表达载体与嗜麦芽窄食单胞菌L1编码基因的重组体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中原核表达。检测L1的等电点,并测定L1金属β-内酰胺酶对多种β-内酰胺类抗生素的稳定性,以及L1对多种β内酰胺类抗生素的酶动力学参数,温度及pH等因素对酶活性的影响。 方法: (1)参照文献,设计合成L1的PCR引物,以临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌710的基因组作为模板,PCR扩增L1酶的编码基因。将L1的PCR产物与pUCm—T载体连接,测定L1的核苷酸序列。 (2)将L1酶基因克隆至表达载体pET-41a(+),转化至宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3)中。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况。 (3)提取重组菌的β内酰胺酶粗提液,等电聚集电泳测定L1的等电点(pI)并观察酶抑制剂和锌离子对酶活性的影响。 (4)以分光光度计测定及比较多种β内酰胺类抗生素对L1型金属β-内酰胺酶及超广谱β内酰胺酶的酶稳定性,并测定L1酶对多种β内酰胺类抗生素的动力学参数,以及温度及pH等因素对酶活性的影响。 结果: (1)序列分析结果显示目的基因片断长873 bp,经GenBank同源性比较,目的基因的氨基酸序列与金属酶L1型编码基因blaS(注册