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一、背景与目的乳腺癌是当今世界威胁女性健康的头号杀手,美国最新统计数据显示乳腺癌的发病率位于女性恶性肿瘤的第一位,死亡率位于女性恶性肿瘤的第二位。即使目前针对乳腺癌的临床治疗手段已日趋成熟,现每年仍有20-40%的患者出现复发转移,这也是引起乳腺癌患者死亡的重要原因。因此对乳腺癌发生发展机制的研究一直是全世界临床医生及科学家关注的焦点。既往对于乳腺癌的发生发展机制的研究大多集中在蛋白质编码基因的突变、扩增、重排、缺失及相关信号通路的激活。并且目前应用于临床的乳腺癌分子靶向药物也都主要是针对蛋白质编码基因变化来设计的。但是,随着研究的深入,人们认识到一种非编码RNA基因（miRNAs）也会影响恶性肿瘤的发生发展。miRNAs是一类通过内源基因编码的长度约为19-24个核苷酸的非编码单链小RNA分子,他们在各种不同的肿瘤中的表达谱均会发生改变。他们通过与靶基因mRNA的3’端非编码区特定位点结合,调控下游基因的表达,从而影响肿瘤的生物学功能。本研究旨在乳腺癌中探索这样一个miRNA-靶基因轴,并验证它在乳腺癌的发生发展中的所扮演的角色。二、材料与方法1、选用2013年-2016年间就诊于南京军区南京总医院普外科的术前未接受辅助治疗患者的手术切除的癌组织和癌旁组织,应用Real-time quantitative PCR、免疫组化及Western blot的方法,检测乳腺癌组织及配对癌旁组织中miR-101及SOX2的表达差异;2、将74例乳腺癌组织根据miR-101的表达量及SOX2的表达水平分成高表达组和低表达组（或阳性表达组和阴性表达组）,结合这些患者的临床病理学特征进行统计学分析;3、在体外实验中首先通过定量PCR检测乳腺癌细胞系中miR-101的基础表达量,选择合适的细胞系进行功能学实验,在PCR验证过表达效率后分别通过MTT,克隆形成,Transwell,划痕实验,流式凋亡实验检测过表达miR-101的乳腺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭迁移能力、凋亡水平等乳腺癌细胞恶性生物学行为的改变;4、在体内实验中将12只裸鼠随机分为两组,对照组和过表达miR-101组,皮下种植移植瘤。在成瘤以后,每隔4天测量瘤径,绘制移植瘤生长曲线。32天后提取各组皮下移植瘤,行HE染色及免疫组化,TUNEL实验等;5、应用荧光素酶实验和western blot来验证miR-101对SOX2的靶向调控作用;6、通过定量PCR及western blot的方法检测乳腺癌细胞系中SOX2的基础表达量,选择合适的细胞系进行功能学实验,在PCR及western blot验证干扰效率后分别通过MTT,克隆形成,Transwell,划痕实验,流式凋亡实验检测抑制SOX2表达后的乳腺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭迁移能力、凋亡水平等乳腺癌细胞恶性生物学行为的改变;7、在乳腺癌细胞系中设置了四组对照实验（空载对照组、过表达miR-101组、过表达miR-1 01+空载质粒组、过表达miR-101+过表达SOX2组）,通过MTT,克隆形成,Transwell,划痕实验,流式凋亡实验检测不同组之间乳腺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭迁移能力、凋亡水平等乳腺癌细胞恶性生物学行为的差异。三、实验结果1、相较于正常乳腺组织,乳腺癌组织中miR-101的表达量下调;2、相较于正常乳腺组织,乳腺癌组织中SOX2的表达量上调。并且在癌组织中SOX2的表达量与miR-101的表达呈负相关关系;3、miR-101低表达及SOX2高表达的患者具有更高的淋巴结转移率、病理学分级和TMN分期;miR-101及SOX2的表达与患者的年龄、T分期、ER状态、HER2状态、分子亚型均无明显相关性4、相比于正常乳腺上皮细胞（MCF-1OA）,MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3中miR-101表达水平较低,而HBL-100表达水平无明显差异;5、MTT实验显示过表达miR-101能有效抑制乳腺癌细胞系的增殖能力,克隆形成实验显示过表达miR-101能有效抑制乳腺癌细胞系的克隆形成能力;划痕实验及Transwell实验显示过表达miR-101能有效抑制乳腺癌细胞系的迁移及侵袭能力;流式凋亡实验显示过表达miR-101能明显诱导乳腺癌细胞系的凋亡;体内实验也显示过表达miR-101能有效抑制乳腺癌细胞系的在裸鼠体内的肿瘤形成能力,并且促进细胞凋亡;6、通过生物信息学网站的查询,我们发现miR-101与SOX2基因3‘端非编码区有结合位点;荧光素酶实验结果显示,过表达miR-101可使野生型SOX2组荧光素酶活性降低,但突变型SOX2组荧光素酶活性无明显变化;western blot实验结果显示过表达miR-101可以使SOX2表达量下调;7、相比于正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）,MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3中SOX2表达水平较低,而HBL-100表达水平无明显差异;8、MTT实验显示抑制SOX2能有效抑制乳腺癌细胞系的增殖能力,克隆形成实验显示抑制SOX2能有效抑制乳腺癌细胞系的克隆形成能力;划痕实验及Transwell实验显示抑制SOX2能有效抑制乳腺癌细胞系的迁移及侵袭能力;流式凋亡实验显示抑制SOX2能明显诱导乳腺癌细胞系的凋亡;9、MTT实验显示过表达SOX2能可逆转由过表达miR-101引起的乳腺癌细胞的增殖抑制,克隆形成实验显示过表达SOX2能可逆转由过表达miR-101引起的乳腺癌细胞的克隆形成能力的抑制;划痕实验及Transwell实验显示过表达SOX2能可逆转由过表达miR-101引起的乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力的抑制;流式凋亡实验显示过表达SOX2能可逆转由过表达miR-101引起的乳腺癌细胞的凋亡增加;western blot实验结果显示,过表达miR-101及干扰SOX2均可引起促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase3的表达上升,抑凋亡蛋白Bcl2表达下降;过表达SOX2可逆转由过表达miR-101引起的凋亡相关蛋白的表达变化。并且过表达SOX2可逆转由过表达miR-101引起的EMT相关蛋白的表达变化。四、结论1、miR-101在乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中表达下降;SOX2在乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中表达上升,在癌组织中SOX2的表达与miR-101的表达呈负相关关系,并且miR-101低表达或SOX2高表达的患者具有更高的淋巴结转移率、病理学分级和TMN分期;2、过表达miR-101可以抑制乳腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭,并促进细胞凋亡;3、SOX2是miR-101的下游靶基因,能够受到miR-101的调控;4、抑制SOX2可以抑制乳腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭,并促进细胞凋亡;5、过表达SOX2可以逆转由过表达miR-101引起的乳腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力的抑制,并且可以逆转由过表达miR-101引起的乳腺癌细胞凋亡的增加。