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桑黄(Phellinus linteus)是目前已知抗癌效果显著的药用真菌,其主要功效成分是多糖。由于人类的大量采摘,使得野生桑黄资源紧缺,因此需要人工培养来获得大量菌丝体来满足市场的需求。近年来对桑黄培养基的研究较多,但是对桑黄多糖分离纯化的研究较少。
本文在桑黄液体培养过程中跟踪检测各项生理指标的变化,对桑黄菌丝体主要营养成分进行测定与分析;采用超声波前处理与热水浸提相结合的方法提取菌丝体多糖;运用大孔吸附树脂脱除粗多糖中的蛋白质;以DEAE纤维素阴离子交换柱和葡聚糖凝胶柱为载体分离纯化得到的多糖,对纯化后的各组分进行紫外扫描,利用气相色谱检测多糖的单糖组成。试验主要得出以下结论:
(1)在150mL装液量、10%接种量、28℃、160r/min的培养条件下,桑黄菌的生长呈一定的周期性;菌丝生长量在168h达到最大13.898g/L;发酵液中的pH值先下降,然后上升,最后稳定于5.5左右;还原糖含量呈“拱”形变化趋势,在120h达到最高5.75g/L;氨基态氮含量先是缓慢上升,72h开始急剧下降,96h之后趋于稳定。菌丝体主要营养成分测定结果为:粗蛋白含量为27.21%,粗纤维含量为9.56%,粗脂肪含量为2.67%,灰分为9.16%,总糖和还原糖含量分别为6.33mg/mL和0.46mg/mL。
(2)采用响应面方法研究超声波辅助提取粗多糖的工艺条件,得到最佳工艺条件为:超声时间46min、超声功率492W及液固比为21时,粗多糖得率为0.71%。
(3)静态试验筛选出D-101-I树脂对蛋白质的吸附效果最好,动态试验结果表明:吸附饱和时间为4h,饱和吸附量为0.3mg/mL,洗脱剂以乙醇为最佳,最佳洗脱浓度为50%;在上样量浓度为0.3mg/mL,pH自然,流速为1mL/min,上样量为2个柱体积(BV)时蛋白的吸附率达到90%;50%乙醇做洗脱剂,用量为2BV时,对蛋白洗脱率较低,且可纯化浓缩多糖。
(4)经DEAE-纤维素初步分离纯化得到了三个组分Ap1、Ap2和Ap3,将Ap2过Sephadex G-100层析柱进一步分离纯化得两个组分Ap2-1和Ap2-2;紫外扫描表明四个组分均无蛋白质和核酸存在;多糖的四个组分中,Ap2-1和Ap2-2含量较高,所以重点探索这两个组分的结构。气相色谱分析表明:多糖组分Ap2-1是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖五种单糖组成的;多糖组分Ap2-2是由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖四种单糖组成的。