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【研究目的】利用染矽尘大鼠模型,观察骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)源外泌体干预二氧化硅诱导肺纤维化的疗效,并初步探索其可能涉及的机制。【研究方法】1.使用全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs,使用流式细胞术及三系分化(成骨、成脂、成软骨细胞谱系)对BMSCs进行鉴定。2.收集第三代BMSCs的条件培养基(conditioned medium,CM),使用差速超速离心法分离纯化外泌体,使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)及蛋白印迹法(Western Blot)对外泌体进行鉴定。3.将受体大鼠随机分为对照组、二氧化硅模型组、BMSCs移植组和外泌体移植组,使用一次性非暴露式气管滴注法建立实验性矽肺肺纤维化大鼠模型(50mg/mL/只)。暴露二氧化硅后第二天,对照组和二氧化硅模型组的大鼠尾静脉回输1.0mL无菌D-PBS,BMSCs移植组的大鼠尾静脉回输1.0mL BMSCs悬液(2×10~6/mL/只),外泌体移植组的大鼠尾静脉回输1.0mL外泌体悬液(200μg/mL/只)。干预外泌体28天后统一处死大鼠,检测肺脏器系数、羟脯氨酸含量(hydroxyproline,HYP)、肺组织病理学改变情况,确定干预的效果。然后通过检测促纤维化因子TGF-β1水平、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物及与EMT相关信号通路蛋白的表达,探索外泌体干预实验性矽肺肺纤维化大鼠模型可能涉及的机制。【研究结果】1.大鼠原代BMSCs最初的形状不均一,多数呈圆形,少数呈梭形。随传代次数的增加,一些非贴壁的细胞逐渐被去除,至第3代时,细胞基本呈均一的长梭形,并显示出大片漩涡样、放射状聚集生长;流式细胞术结果显示第三代BMSCs高表达CD90、CD73和CD44(表达率分别为99.58%、99.63%和99.85%)标志物,低表达CD45和CD11b(表达率为5.58%和0.04%)标志物;此外茜素红S,油红O和甲苯胺蓝染色显示BMSCs成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞谱系。上述结果符合间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)鉴定的最低标准,证实本研究第三代绝大多数细胞都是BMSCs。2.TEM结果显示使用差速超速离心法提取的外泌体的形状为圆形或椭圆形,大小不均一,有完整的膜结构,呈典型的杯状,内含低电子密度物质;NTA结果显示外泌体的粒径主峰为127.5nm,占所有颗粒的97.5%,颗粒浓度为7.5E+6/mL;Western Blot结果显示可以检测到外泌体标志蛋白CD63的表达。上述结果符合外泌体的鉴定标准,证明使用差速超速离心法可以成功从BMSCs的CM中提取出外泌体。3.肺系数:暴露二氧化硅后,与对照组相比,二氧化硅模型组、BMSCs移植组和外泌体移植组大鼠的肺系数显著增加(P<0.05)。与二氧化硅模型组相比,外泌体移植组和BMSCs移植组大鼠的肺系数降低,但三组的差异无统计学意义。4.肺组织中HYP的含量:暴露二氧化硅后,与对照组相比,二氧化硅模型组大鼠肺组织中的HYP含量增加(P<0.05)。然而移植外泌体和BMSCs后,与二氧化硅模型组相比,肺组织中的HYP含量减少(P<0.05)。5.肺组织病理学变化:H&E和Masson三色染色结果显示,暴露二氧化硅后,与对照组相比,二氧化硅模型组大鼠的肺泡结构严重破坏,出现大量的炎性细胞浸润,伴有矽结节形成,蓝染的胶原纤维增加,肺纤维化病变程度加重。然而移植外泌体和BMSCs后,炎性细胞浸润面积减小,矽结节的数量减少,蓝染的胶原纤维减少,肺泡结构和纤维化程度都有所改善。此外,改良Ashcroft半定量评分结果与病理情况一致(P<0.05)。6.血清中促纤维化TGF-β1的表达水平:暴露二氧化硅后,与对照组相比,二氧化硅模型组TGF-β1表达水平升高(P<0.05)。然而移植外泌体和BMSCs后其表达水平降低(P<0.05)。7.EMT标志蛋白的变化:暴露二氧化硅后,与对照组相比,二氧化硅模型组肺组织的上皮标志物CK19和E-cadherin的表达减少,纤维化标志物α-SMA表达增加(P<0.05)。而移植外泌体和BMSCs后,CK19和E-cadherin的表达增加,α-SMA的表达减少(P<0.05)。8.Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达情况:免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)结果显示暴露二氧化硅后,与对照组相比,二氧化硅模型组中的β-catenin、P-GSK-3β和cyclin D1的表达增加,GSK-3β表达减少。而移植外泌体和BMSCs后,GSK-3β表达增加,β-catenin、P-GSK-3β和cyclin D1表达减少。【研究结论】1.外泌体移植可以发挥和BMSCs类似的抑制由二氧化硅诱导肺纤维化的疗效,表明外泌体可以单独作为一种无细胞干预手段用于矽肺纤维化治疗。2.外泌体移植可以通过降低促纤维化因子TGF-β1表达水平、抑制EMT的进展改善由二氧化硅诱导的肺纤维化。3.暴露二氧化硅后,与EMT发生发展密切相关的Wnt/β-catenin信号通路异常活化,而移植外泌体后衰减了Wnt/β-catenin信号,这可能是其抗纤维化涉及的机制之一。