论文部分内容阅读
朱槿(Hibiscus rosa-sinensis Linn.)属锦葵科木槿属的常绿灌木，又名中国蔷薇，广泛种植于热带和亚热带地区。近年来，朱槿曲叶病在我国广东、广西有日趋严重之势，田间病株率高达80％以上。典型症状表现为朱槿病株叶脉增厚，叶片向上卷曲，叶背有耳状突起，叶子变小黄化，植株矮缩，开花受阻，最终造成落叶或整株死亡。
本研究调查了我国南方广东、广西、福建、海南四省的朱槿曲叶病发生情况，检测鉴定了朱槿曲叶病的病原病毒；获得了11个木尔坦棉花曲叶病毒(cotton leaf curl Multan virus，CLCuMV)朱槿分离物DNA-A组分和β卫星分子的全基因序列，分析比较了它们的种群遗传特征；针对CLCuMV分离物FC03和Par21，构建了该病毒及其卫星分子的侵染性克隆；开展了CLCuMV朱槿分离物的致病性研究，取得了如下进展：
朱槿曲叶病病害调查及PCR检测结果显示：广东省5个地区市和广西南宁朱槿曲叶病病情严重，调查的广东汕头、韶关市、福建省厦门市、海南省三市尚未发现该病害。利用双生病毒简并引物PCR检测采集的样品，扩增得到570bp的特异片段。NCBI BLAST表明与CLCuMV DNA-A相应序列相似性为92-99%。
在测定的570bp片段序列基础上，克隆和测序了来自广东的8个分离物和广西的3个分离物的DNA-A基因组。11个分离物DNA-A均具Begomovirus结构特征，为单链环状，全长为2735nt-2738nt，推导编码6个ORF，分别是位于病毒链上的AV1、AV2及位于互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4，在AV2与AC1之间具非编码区(IR)。
BLAST分析表明，11个分离物的DNA-A序列与GenBank中相似性最高的为CLCuMVA组分，相似性为89%-100%之间，11个分离物DNA-A序列之间的相似性也大于99%。表明我国南方朱槿曲叶病病原为CLCuMV。
选取相似性大于85%的Begomovirus与上述11个分离物构建系统进化树，系统进化关系分析显示：与11个分离物亲缘关系最近的为CLCuMV，其中与侵染中国朱槿和黄秋葵的CLCuMV分离物亲缘关系较近，而与印度朱槿分离物关系较远。这些结果进一步证明，侵染我国南方朱槿的病毒分离物属于CLCuMV，且该分离物与引起两广地区黄秋葵黄脉曲叶病的CLCuMV是同一个株系。
PCR分子检测结果表明：侵染朱槿的11个CLCuMV分离物均伴随有DNAβ卫星分子。这些DNAβ全长1351-1364nt，推导其互补链上编码一个ORF(C1)，11个分离物DNAβ的全长序列相似性大于98%，表明不同地理种群的CLCuMV-DNAβ的变异比较小。与GenBank CLCuMV DNAβ相似性为83.2%-99.3%。系统进化关系分析显示，所获得11个分离物与侵染中国朱槿的其它CLCuMV DNAβ亲缘关系近，而与而印度朱槿分离物亲缘关系较远。
选取其中的CLCuMV朱槿分离物FC03和巴基斯坦棉花分离物Par21，成功构建了二者DNA-A的侵染性克隆pB-H1.85A、pB-C1.85A，及其β卫星分子侵染性克隆pB-H2β、pB-C2β。农杆菌注射接种本生烟结果显示：(1)pB-H1.85A和pB-C1.85A分别单独接种的植株不表现明显症状，但PCR可检测到CLCuMV DNA-A组分的存在，说明该病毒可以系统侵染本生烟但症状不明显；(2)pB-H2β和pB-C2β单独接种植株表现轻微的曲叶症状，但在接种植株中PCR未检测到DNAβ分子的存在，表明DNAβ依赖病毒DNA-A才能复制；(3)pB-1.85A和pB-2β两者共同接种的本生烟植株表现严重的叶片卷曲和皱缩症状，且在这些显症植株中均可检测到该病毒DNA-A和DNA-β;(4)朱槿分离物FC03和棉花分离物Par21的DNA-A和DNA-β的侵染性克隆交叉组合接种本生烟，也产生了典型的曲叶症状。这些结果说明：所构建的侵染性克隆pB-1.85A和pB-2β均具有侵染性，证明了β分子是A组分诱导寄主植物产生典型曲叶症状所必需的；不同寄主的DNA-A和DNA-β也能够互相交流产生病害症状。
利用pBinPLUS构建的侵染性克隆基因枪法和农杆菌法接种棉花和朱槿，但接种植株没有表现任何症状；PCR也未检测到DNA-A组分和DNA-β分子的存在。我们推测CLCuMV侵染性克隆不能够在多年生草本植物棉花和木本植物朱槿中复制，或者是侵染朱槿的CLCuMV具有寄主特异性，不能够侵染棉花，要证实这些还需要进一步的研究。因此，本研究为进一步开展该病毒致病性、CLCuMV扩散定殖至我国棉花产区的风险、病害侵染循环及病害控制技术等研究奠定了基础。