低温纤维素酶基因的克隆、表达和产淀粉酶嗜热菌的筛选及基因克隆

来源 :自然资源部第三海洋研究所 | 被引量 : 19次 | 上传用户:qyxiao3771
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从深海沉积物样品ES0109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3,对其16s rDNA序列的分析表明该菌与假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas.sp)的Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性都为99%。DY3在8℃环境中分泌的胞外酶能水解羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose,CMC)。根据已知纤维素酶基因的序列,设计PCR引物从DY3总DNA中扩增出一个约1.5kb的片段并将该片段克隆到T载体上进行测序。分析表明该片段长为1479bp,是一个属于糖基水解酶家族5的纤维素酶基因,命名为celX,其编码的酶为CelX。CelX有492个氨基酸,预测的分子量为52.7kDa,包含一个糖基水解酶家族5的催化结构域。分析粗酶发现CelX作用的最适温度为40℃,最适pH在6-7之间;在20℃保温60mins后仍有98%活力,酶的稳定性随温度的升高而下降,在55℃时该酶极不稳定,保温60min后完全丧失活力。利用pET-GST载体,celX基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得融合表达。表达纯化的产物能降解CMC产生纤维二糖和纤维三糖,分解纤维五糖产生纤维二糖和纤维三糖,分解纤维四糖产生纤维二糖,对二糖或三糖底物则没有分解作用。 从西藏羊八井热泉中筛选到一株嗜热高温菌YBJ-1。其16s rDNA(1511bp)序列与栖热菌(Thermus scotoductus ITI-252T)的同源性为98%。通过PCR方法将克隆了Thermus.sp YBJ-1的淀粉酶基因(amyT)全长开放阅读框,并克隆到T载体中进行测序。分析表明,amyT的ORF全长为1767bp,编码588个氨基酸。推导的氨基酸序列与嗜热脂肪芽孢杆菌的α环糊精酶(Bacillus stearothermophilus α-cyclodextrinase)和栖热菌IM6501的麦芽糖淀粉酶(Thermus sp.IM6501 maltogenic amylase gene)的分别有99%和96%的同源性,与嗜热脂肪芽孢杆菌的新普鲁兰酶(neopullulanase)的同源性为81%。
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