DNA水凝胶是组成成分中含有DNA的三维高分子聚合物。DNA水凝胶具有良好的生物相容性、序列可设计性、可降解性、易于合成和修饰等优点。因此,DNA水凝胶作为三维宏观DNA材料的代表,己经应用于生物传感、药物释控、细胞培养和3D打印等领域。但是,以往DNA水凝胶的合成方法,往往需要大量的高浓度DNA作为原材料,极大地增加了合成成本,也限制了 DNA水凝胶的应用。因此,为解决这一问题,本论文利用滚环扩增技术,构建了一系列功能化DNA水凝胶,并将其应用于纳米酶催化、界面传感系统和便携式检测等领域。本论文的研究内容如下:(1)纳米模拟酶@DNA水凝胶的制备及其在生化分析中的应用:纳米模拟酶由于制备容易和成本低廉等优点而受到广泛关注。但是,与天然的蛋白酶相比,人工制备的纳米模拟酶在复杂的临床样品中容易钝化,使其催化能力降低,因而限制了纳米模拟酶在生物医学分析中的应用。为解决该问题,我们利用纯DNA水凝胶负载纳米模拟酶,成功构建了一种新型的纳米模拟酶@DNA水凝胶复合催化体系。结果表明,以金纳米颗粒(goldnanoparticles,AuNPs)作为模型酶形成的AuNPs@DNA水凝胶,能够保留AuNPs在血清样本中的催化能力,而单独的AuNPs在相同情况下则完全丧失催化活性。将AuNPs@DNA水凝胶用于催化反应,可以实现血清中过氧化氢和葡萄糖的检测,检测限分别为1.7 μM和38 μM,与蛋白酶催化能力相当。此外,纳米模拟酶@DNA水凝胶展示了良好的重复使用性,其催化保护机理也得到了阐释。该纳米模拟酶@DNA水凝胶对于维持纳米模拟酶在复杂样品中的生物医学分析,具有普适性和潜在应用价值。(2)自塑形的固定于界面的DNA水凝胶的制备及其在生物传感中的应用:将生物相容性好、可塑性强和含水量高的水凝胶作为三维支架,与界面传感系统联用,制备固定于界面的DNA水凝胶,可以拓展水凝胶在生物传感领域的应用。我们利用界面引物诱导策略,通过DNA扩增技术首次合成了固定于透明氧化铟锡电极表面的纯DNA水凝胶,该凝胶能稳定包裹辣根过氧化物酶,在不同条件下均呈现良好的稳定性。值得注意的是,DNA水凝胶的特殊结构使得小分子靶标可以在水凝胶中自由扩散,大分子干扰物被阻挡在水凝胶外,从而实现了过氧化氢在血清中的比色分析和电化学分析,检测限分别为22 nM和13 nM。而且,该凝胶还可以包裹胆红素氧化酶对胆红素进行定量分析,对胆红素的检测限达到32 nM,检测范围为0～250 μM,适用于黄疸病的诊断。此外,固定于界面使得酶@DNA水凝胶易于再生,6次循环后仍保持高催化活性,有利于界面水凝胶生物传感系统的循环使用。DNA水凝胶与界面传感系统的成功联用使得水凝胶在医学诊断和环境监测方面展现出光明的潜在应用前景。(3)脱氧核酶功能化的DNA水凝胶用于循环肿瘤DNA的宏观可视化检测:基于脱氧核酶功能化的DNA水凝胶,我们提出了循环肿瘤DNA(circulating tumorDNA,ctDNA)的宏观可视化检测方法,能同时实现ctDNA的可视化定性和定量分析。我们首先利用靶标ctDNA触发滚环扩增反应,合成具有G-四联体结构的DNA水凝胶,使痕量的ctDNA变成三维宏观的DNA水凝胶,仅凭肉眼观测即可定性。而且,该DNA水凝胶可结合血红素,进而利用G-四联体/血红素复合物的脱氧核酶活性,催化显色底物,通过观察颜色变化达到对ctDNA定量分析的目的。结果表明,ctDNA在1pM～10nM范围内具有良好线性关系,检测限0.32 pM。本方法也可用于鉴别ctDNA的单碱基突变体,并且成功地应用于临床实际血液样本的模拟分析。此外,本实验无需借助昂贵的仪器设备,在条件有限的贫穷地区具有潜在应用价值,同时为裸眼检测DNA新方法的建立也提供了借鉴。(4)酶和电子传递双功能化的DNA水凝胶的构建及其在电化学分析中的应用:基于表面引物诱导策略和核酸等温扩增技术,在电极表面构建了具备酶和三维电子传递双功能的DNA水凝胶,并用于电化学分析。一方面,我们通过对滚环扩增模板序列的设计,合成了包含G-四联体结构的DNA水凝胶,再加入血红素使之与G-四联体结合,形成具有过氧化氢酶活性的脱氧核酶。另一方面,DNA水凝胶的三维网络可以结合大量电活性探针,形成三维电子传递载体,介导脱氧核酶和电极之间的电子转移过程。实验结果表明,我们构建的双功能水凝胶成功应用于过氧化氢的电化学分析,在磷酸缓冲溶液和血清中对过氧化氢的检测限分别为0.33 μM和0.41 μM。值得注意的是,该凝胶实现了电化学信号从常规的一维信号向三维信号的转变。而且,在靶标过氧化氢加入后,本方法可即时检测,无需后续繁琐的处理过程,极大地缩短了检测时间。此外,该凝胶还表现出良好的抗干扰性、稳定性和重复使用性能。重要的是,酶活性和电子传递功能的集成,实现了 DNA水凝胶生物学功能和支架功能的整合,不但能应用于电化学检测,而且其设计思路也对其它多功能DNA水凝胶的制备和应用具有借鉴意义。(5)基于DNA构象变化的DNA水凝胶用于便携式和可视化的钾离子检测:基于离子引发的DNA构象变化,我们制备了一种DNA水凝胶微孔板用于钾离子(potassium ion,K+)的便携式和可视化检测。首先将富含G的DNA探针包埋在琼脂糖凝胶中。当靶标K+溶液点入凝胶后,可触发DNA探针形成G-四联体结构,特异性荧光染料随之结合,并在原位产生荧光增强效应。结果表明,该方法只需将待测溶液点入凝胶上的微孔便可自动实现样品注入、信号响应和结果读取全过程,操作方法十分简便。而且,我们可通过对K+形成的光环的荧光强度的分析,实现对K+的定量检测。本方法对K+的检测限达到0.34 mM,同时表现出良好的特异性,并且有望应用于K+的高通量筛选。此外由于可以将本设计中的DNA探针替换为针对其他靶离子的识别序列,因此也适用于其他离子的检测。