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目的：
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,胃癌的发生发展是一个多阶段的过程,涉及到多个基因改变,包括原癌基因的激活,抑癌基因的失活,抗凋亡基因活性增强和促凋亡基因活性减弱等,从而导致细胞增殖失控、恶性转化、侵袭和转移等-系列的改变。原癌基因c-met的高表达与胃癌的关系十分密切。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是通过反义RNA与正链RNA形成RNA特异性地抑制靶基因的现象,通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNlA,从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到沉默基因表达的目的。本研究首先通过RT-PCR和荧光定量PCR技术,检测四种不同分化的胃癌细胞株的c-met表达情况,找出其中高表达的一株作为研究对象,然后通过观察沉默原癌基因c-met的表达对被选中的胃癌株体外生长的抑制作用,探讨RaNAi原癌基因c-met作为胃癌基因治疗靶点的可行性及有效性。
方法：
1.通过RT-PCR和荧光定量PCR,检测四种不同分化程度的胃癌细胞株中的c-met基因表达情况,选出其中一株作为RNAi的研究对象。胃癌细胞株分别是高分化MKN-28、中分化SGC-7901、低分化MKN-45和低分化胃癌细胞癌MGC-803。
2.本研究选择在细胞内稳定表达,并且转染效率高,适用于哺乳动物细胞长时间的基因干扰研究的短发夹shRNA(short hairpin RNA,shRNA)方法,设计并合成质粒,通过Lipofectamine 2000转染试剂转染入胃癌细胞株MKN-45中,同时设立阴性对照和空白对照组。
3.通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术,观察转染24小时和48小时后,低分化胃癌细胞株MKN-45中原癌基因c-met的mRNA的CT值的变化,由公式2-△△CT计算mRNA抑制率。
4.通过蛋白印迹(western blot)技术,观察转染24小时和48小时后,胃癌细胞株MKN-45中原癌基因c-met的蛋白变化。
5.通过MTT法,观察转染24小时和48小时后胃癌细胞株MKN-45中细胞在酶联免疫仪上的吸光度A值,计算细胞存活率。
结果：
1.在四种不同分化的胃癌细胞株中,低分化胃癌细胞株MKN-45中原癌基因c-met有高表达,被选中作为RNAi研究对象。
2.实时荧光定量PCR结果显示,c-met shRNA转染24小时和48小时后,与空白对照组相比,c-met的mRNA的抑制率分别为56％和88％,而内参β-actm的mRNA表达无明显抑制。
3.蛋白印迹结果显示,与空白对照相比,c-met shRNA转染24小时(0.812比0.640)和48小时后使细胞c-met的蛋白表达水平明显下降(0.811比0.331)。
4.MTT法显示,c-met shRNA转染24小时和48小时后,细胞存活率均有明显的降低(65.9％和59.6％)。
结论：
1.胃癌细胞株MKN-45中原癌基因c-met高表达。
2.C-met shRNA可降低胃癌细胞株MKN-45中原癌基因c-met的mRNA和蛋白表达水平。
3.C-met shRNA对胃癌细胞株MKN-45的细胞存活有明显的抑制作用。