鲢鱼肌球蛋白—魔芋葡甘露低聚糖复合物的制备及功能特性研究

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本论文以鲢鱼肌球蛋白(myosin protein,Ms)和魔芋葡甘露低聚糖(konjac oligo-glucomannan,KOG)为主要原料,以葡萄糖为对照组,利用糖基化反应制备Ms-糖复合物,并对糖基化反应产物的理化性质、结构及功能性等进行了较为系统的研究,旨在深入研究肌球蛋白与糖的糖基化改性及其复合物的功能性,为生产提供理论基础。以魔芋粗粉为底物,采用中性β-甘露聚糖酶进行酶解反应,制备KOG寡糖。选择酶解时间、酶解温度、酶解pH及酶添加量为单因素,以魔芋胶酶解液的最终黏度为指标,研究影响酶解反应的因素,并选出最优的酶解条件。根据单因素结果设计的正交实验最后得出的最优工艺参数为:酶解时间为2 h,酶解温度为50oC,pH为6.0及酶添加量为150 U/g。通过对魔芋胶与魔芋葡甘露低聚糖的FTIR分析可知,酶解反应较为彻底。糖基化复合物中的总糖含量明显增加,赖氨酸与精氨酸的相对含量明显降低,动态黏度出现不同程度的增加,等电点、总巯基含量及表面疏水性随着反应时间的延长逐渐减低,两种不同的糖供体修饰肌球蛋白糖基化反应,其变性峰值都有不同程度的升高。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),随着反应时间的延长,糖基化复合物的亚基电泳淌度变慢,说明糖基化复合物的分子量高于原蛋白。此外,傅里叶红外证明了Ms以共价键形式引入了糖分子。扫描电镜(SEM)研究发现,Ms的表面结构与其糖基化复合物的明显不同,后者聚集体逐步分散开来,尤其是Ms-KOG糖基化复合物;AFM分析表明,经糖基化过后,所有样品颗粒的表面结构都比原蛋白颗粒大且更加分散;通过DLS分析结果可知,糖基化复合物的粒径分布不一,减少了蛋白质分子的聚集。CD分析二级结构表明,与Ms相比,糖基化复合物的α-螺旋与无规则卷曲结构含量降低,β-折叠与β-转角结构含量增加。内源性荧光分析表明,与Ms相比,糖基化复合物的内源性荧光强度随着反应时间的增加而下降,且在反应一定时间后出现红移现象。此外,KOG作为一种多羟基且含一定量的支链的低聚糖在与Ms糖基化后,其空间位阻效应比葡萄糖作用更明显,所以其相对荧光强度下降幅度更大且红移现象出现的更早。从功能性的研究发现,Ms-糖糖基化复合物的溶解性(尤其是在低盐溶液中)、热稳定性较Ms都有了显著地提高,随着反应时间的延长,糖基化复合物的乳化性能(包括乳化活性与乳化稳定性)表现出先增后减的态势。此外,通过SDS-PAGE对糖基化复合物体外消化能力的分析可知,Ms的改性复合物比蛋白本身更容易消化。此外,从本实验中还可以看出,消化过程主要发生在肠道。利用糖基化复合物来制备蛋白膜,并对其物理性质做了研究,与未发生糖基化反应的Ms膜相比,糖基化反应能够导致Ms膜色泽加深,亲水性降低,延长率增加以及水蒸气渗透率降低。此外,与Ms-葡萄糖糖基化改性膜相比,Ms-KOG糖基化改性膜的色泽较深,延长率较差,然而其在水中的稳定性,拉伸强度和水蒸气阻隔性能均较好。本研究通过糖基化改性显著地改善了Ms功能性质,同时明确了糖基化改善Ms热稳定性的机理,为蛋白的实际应用提供了理论依据。
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