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5羟色胺(serotonin,5-HT)是1948年发现的一种重要的神经递质。5羟色胺能系统在产生和调节多种认知和行为学的功能上起到了关键性的作用,比如睡眠,情绪、疼痛、成瘾、性行为、抑郁、焦虑、酒精、攻击行为、学习等。5羟色胺 1A 受体(serotonin1A,5-HT1A)是5-HT 受体中分布最广泛的一个,参与了广泛的生理活动功能。大量的药理学实验及临床研究发现,5-HT1A 受体可能与重性抑郁障碍、焦虑和药物成瘾等的发生发展、治疗及预后密切相关,目前在治疗情感障碍等疾病中,5-HT1A 受体已经成为了治疗靶点,受到越来越多的关注。所以研究和理解5-HT1A的特性,将有助于我们进一步了解5-HtT1A受体参与疾病过程的机制,为临床更有效的治疗提供理论依据和思路。为此我们克隆小鼠5-HT1A基因,并将其连接到真核表达载体 pEGFP-N1上,构建了真核表达质粒5-HT1A-EGFP。转染入哺乳动物细胞HEK293和PC12细胞中,使其表达带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的5-HT1A受体融合蛋白,运用激光共聚焦成像系统,观察发现该受体表达于细胞膜上。为了使受体表达均一和强度适中,为做药物筛选的平台打下基础,我们进一步筛选了稳定表达5-HT1A-EGFP的PC12细胞系。在此基础上本实验对该融合蛋白的功能进行了检测,给予不同浓度的5羟色胺激活,引起稳定表达5-HT1A-EGFP的PC12 细胞内 cAMP 水平降低。同时给予 5 羟色胺与5-HT1A特异性的拮抗剂 WAY-100635,观察到WAY-100635能够阻止5-HT 对细胞内 cAMP 水平的减少。本实验进一步以稳定转染PC12作为药物筛选的平台,对新药 buspirone,一种选择性的5-HT1A受体的激动剂的作用进行了药效的检测。研究结果显示,给予PC12细胞buspirone不同剂量刺激,细胞内 cAMP 水平呈现剂量依赖性的降低。同时给予受体选择性的拮抗剂WAY-100635,观察到拮抗剂WAY-100635可以逆转这种由激动剂buspirone带来的抑制作用。细胞膜上的蛋白和脂质成分不均匀分布,形成了脂筏(lipid raft)结构,而脂筏对于维持膜蛋白的稳定性和功能发挥着重要的作用。可能影响着GPCR受体和配体的结合以及受体与G蛋白和下游效应分子的结合。5羟色胺受体在细胞膜上的运动,是受体与效应器以及受体与配体相互作用的基础,所以我们采用荧光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技术研究了 5-HT1A 受体在细胞膜上的转运过程。给予细胞膜选定区域最大激光强度的刺激,使细胞膜局部荧光漂白,去除最强激光刺激后,继续200s左右的时间观察,漂白区荧光强度有所恢复,证明了受体在细胞膜上的转运。使用胆固醇抑制剂MβCD观察到,荧光恢复的效率有所降低,结果显示出,胆固醇及细胞膜脂筏结构对于5-HT1A受体功能的重要性。本课题成功筛选了稳定转染的PC12细胞系,为下一步研究5-HT1A受体的转运和作用机制提供了实验平台。