论文部分内容阅读
流感是由流感病毒引起一种急性呼吸道传染性疾病,是全球流行性传染病的主导因素。流感引起的急性呼吸道疾病具有传播广,易爆发,起病急和发病快等特点,严重时可引起致死性肺炎。流感严重危害人类健康,急需建立有效的动物模型来探索其致病机理和感染机制。然而,目前已建立的流感动物模型大多存在一定的缺陷和限制,因而需要寻找更具临床模拟性的动物模型。树鼩由于其独特的进化地位和生物学特性,以及在新陈代谢、生理生化和免疫学等方面与人类的相似性,被认为是有望代替灵长类动物的新型实验动物。目前,树鼩已广泛用于生命科学的研究,尤其是作为人类疾病动物模型,包括病毒感染性疾病、神经系统疾病以及肿瘤等疾病模型。本研究旨在通过树鼩体内和体外感染试验,探索多种细胞因子对其感染流感病毒后的免疫反应情况。体外试验时,我们首先将成功分离的树鼩外周血单核细胞进行体外培养后给以H9N2流感病毒刺激,然后采用荧光定量PCR检测相关细胞因子在mRNA水平的表达量,以此评价树鼩外周血单核细胞对抗流感病毒的免疫应答情况。结果表明,与未给毒的对照组相比,树鼩外周血单核细胞在流感病毒刺激后相关细胞因子的表达量都有不同程度增加,除IL-4和MCP-1表达水平无显著差异变化外（P>0.05）,IL-6、IL-10、IFN-β、TNF-α有3-5倍的增加（P<0.05）;IL-13、CCL-5、CXCL-9和IP-10有8-18倍的增加（P<0.05）;值得指出的是,IL-8表达上调程度最为明显,有高达800倍的增加（P<0.05）。体内实验,首先对树鼩进行滴鼻接种H9N2流感病毒(浓度106TCID50/250μl),在感染第2天和第4天时解剖收取树鼩呼吸道组织（鼻甲骨、气管和肺组织）,然后进行病毒滴度和细胞因子m RNA表达量的检测以及HE染色观察组织病理变化。结果表明,树鼩感染H9N2流感病毒后,在其鼻甲、气管、肺的组织匀浆液中均能检测出具有复制力的流感病毒,病毒滴度在102.5TCID50/ml到106TCID50/ml之间。树鼩体内感染H9N2流感病毒后呼吸道组织部分细胞因子和趋化因子包括IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a、IL-8、IL-13、IP-10、RANTES（CCL-5）、MIG（CXCL-9）、IFN-β、MCP-1（CCL-2）在mRNA水平上的表达呈不同程度升高;病理切片HE染色显示感染H9N2流感病毒的树鼩鼻甲骨和气管粘膜处有大量炎症细胞堆积以及间隙增宽等现象,肺腔内有明显的渗出物,肺间质充血,间隔增宽,并且有大量红细胞浸润。以上结果说明流感病毒能成功感染树鼩,并可在其呼吸道组织中进行复制。最后,为了筛选出可用于树鼩细胞因子检测的商业化ELISA试剂盒,本研究还进行了人源IL-8、IP-10抗体与树鼩IL-8、IP-10抗原交叉反应试验。结果发现:感染H9N2流感病毒的树鼩IL-8蛋白浓度从212.46pg/ml到642.12pg/ml,而正常组树鼩IL-8蛋白浓度从73.37pg/ml到83.99pg/ml,表明感染组IL-8的蛋白表达量明显高于正常组;感染H9N2流感病毒的树鼩IP-10蛋白浓度从49.44pg/ml到93.20 pg/ml,而正常组树鼩IP-10蛋白浓度从33.73pg/ml到79.43pg/ml,表明感染组IP-10与正常组相比,其表达量不明显。综上所述,首先,树鼩外周血单核细胞体外感染流感病毒后分泌多种细胞因子的mRNA表达量都有不同程度的升高,表明树鼩对流感病毒产生基本的免疫应答反应;其次,树鼩滴鼻接种流感病毒后在其呼吸道可检测到病毒滴度、细胞因子和趋化因子以及组织病理变化,证明流感病毒可成功感染树鼩并在呼吸道组织中进行复制。最后,人源IL-8抗体与树鼩IL-8抗原具有免疫交叉反应,而人源IP-10抗体与树鼩IP-10抗原却无交叉反应。这些结果表明树鼩可作为流感病毒动物模型,但仍需要开发相关的特异性抗体检测试剂盒。