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目的近年来,随着生活节奏的加快,乳腺癌在全球女性中的发病率逐年升高,已成为对全球女性威胁最大的恶性肿瘤,据统计,每百名患有癌症的中国女性中,乳腺癌患者可达32名。虽然如今的技术手段能够让乳腺癌早发现,早治疗,但乳腺癌的致死率居高不下,造成这种结果的主要原因就是癌细胞的增殖转移。当乳腺癌发生转移时,手术的疗效通常不如人意。因此,找出乳腺癌细胞增殖和转移的发生机制是治疗乳腺癌的关键。已有研究表明,长链非编码RNA(lnc RNA)参与并调节肿瘤的增殖和转移机制,是研究肿瘤增殖和转移机制一个新的切入点。而结直肠癌差异表达基因(Colorectal Neoplasia Differentially Expressed,CRNDE)是2011年在结直肠癌中发现的一种新lnc RNA,对癌细胞增殖和转移入侵起到重要的调节作用,而我们通过预实验发现,与低转移乳腺癌细胞MCF-7相比,CRNDE在高转移细胞MDA-MB-231中表达水平明显下调,表明CRNDE与乳腺癌细胞的增殖、转移可能有关,但具体的作用机制尚不清楚。所以本研究旨在探讨lnc RNA CRNDE是否参与调节乳腺癌细胞的转移,增殖及其作用机制。方法1.体外培养人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231和人类低转移乳腺癌细胞MCF-7。根据转染质粒的不同分为对照组:Si RNA-control和实验组:Si RNA-CRNDE(Si RNA-420,Si RNA-566,Si RNA-718,Si RNA-783)。将MCF-7和MDA-MB-231细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒,24 h后,用显微镜观察转染后细胞中的GFP荧光,选出转染效率最佳的质粒作为实验研究对象。2.将MCF-7和MDA-MB-231细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒48 h后,提取细胞中的总RNA,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(q RT-PCR)和逆转录PCR检测乳腺癌细胞中上皮细胞-间充质转化(EMT)相关基因:间充质性细胞标志物波形蛋白(Vimentin),上皮细胞标志物钙粘蛋白(E-cadherin),转录因子(Snail)在m RNA水平上的变化。增殖相关基因:细胞周期蛋白依赖激酶(CDK2,CDK4),细胞周期蛋白(Cyclin D,Cyclin E),细胞周期相关转录因子(E2F-1),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(P21),在m RNA水平上的变化。3.将MCF-7和MDA-MB-231细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒48 h后,提取两种乳腺癌细胞中的细胞总蛋白。用蛋白免疫印记(Western blot)检测两种乳腺癌细胞中EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin的表达情况,细胞周期相关转录因子E2F-1的表达情况,以及Rb磷酸化情况。4.,将两种乳腺癌细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒24 h后,进行伤口愈合实验和Transwell实验,通过与对照组比较,检测转染入敲降组质粒后迁移距离及发生侵润的细胞数量,分析乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的迁移能力和侵润能力是否发生改变。5.利用流式细胞术(FCM)检测转染后对照组和实验组细胞周期中G1/G0期的百分比变化,以及细胞克隆形成实验中的克隆形成率,分析CRNDE表达水平是否与乳腺癌细胞的增殖能力有关。结果1.与人类低转移乳腺癌细胞MCF-7细胞相比,CRNDE在人类高转移乳腺癌细胞中的表达量明显下调。2.细胞转染的荧光显微镜和q RT-PCR结果发现,在MCF-7中,Si RNA-420有最佳的转染效率(70%-80%)和敲降能力;在MDA-MB-231中,Si RNA-718有最佳的转染效率(70%-80%)和敲降能力,因此我们将这两种质粒分别作为两种乳腺癌细胞的实验质粒。3.在乳腺癌细胞中转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒后,进行伤口愈合实验发现,与对照组相比,MCF-7和MBA-MD-231细胞的迁移能力均明显增加。4.将MCF-7细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒后,进行transwell实验检测,检测结果发现,与对照组相比,MCF-7细胞的侵袭能力增强。5.将MCF-7和MDA-MB-231两种细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control后,用q RT-PCR检测细胞中EMT相关基因E-cadherin,Vimentin和Snail在m RNA水平上发生的变化。实验结果发现,与MCF-7对照组相比,CRNDE敲降后,MCF-7细胞中的E-cadherin在m RNA水平的表达量显著下降,Vimentin在m RNA的表达量明显上调,Snail在m RNA水平上也有明显的上升趋势。与MDA-MB-231细胞的对照组相比,CRNDE敲降后,MDA-MB-231细胞中E-cadherin在m RNA水平上的表达量发生明显下调,但Vimentin和Snail在m RNA水平上的变化并不明显。6.将MCF-7和MDA-MB-231两种细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒后,用Western blot检测,结果发现,与对照组相比,实验组中Vimentin和E-cadherin在蛋白质水平的表达量变化与其在m RNA水平上的变化一致。7.将两种乳腺癌细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒,q RT-PCR检测结果发现,与对照组相比,CRNDE敲降后,MCF-7细胞中cyclin D在m RNA水平的表达量明显上升,MDA-MB-231细胞中cyclin E在m RNA水平明显上调,同时MCF-7和MDA-MB-231细胞中CDK2在m RNA水平均明显上升。8.将MCF-7细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒后,用q RT-PCR检测发现,与对照组相比,CRNDE敲降后,细胞中E2F-1和P21的m RNA表达水平同时显著上调,用Western blot检测发现,Rb磷酸化水平明显上调,同时E2F-1在蛋白质水平上的表达水平明显上调。9.将两种乳腺癌细胞转染入Si RNA-CRNDE和Si RNA-control质粒后,用流式细胞术检测细胞周期中G1/G0期的百分比变化,并利用细胞克隆形成实验的克隆形成率分析两组细胞的增殖变化,结果发现CRNDE对乳腺癌细胞的增殖能力的作用并没有发生明显变化。结论1.Lnc RNA CRNDE的表达量与人类乳腺癌细胞的转移性负相关,即在高转移性乳腺癌中低表达,在低转移性的乳腺癌中高表达。2.CRNDE可能通过转录因子Snail的介导抑制EMT的发生,抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的转移和入侵。3.CRNDE对细胞周期及细胞增殖没有产生统计学意义的显著作用。4.在乳腺癌细胞中,Lnc RNA CRNDE的表达量可能作为判断细胞转移能力的新指标。