引言糖尿病患者的心肌细胞会发生异常改变，其能量代谢过程效率低下，且几乎不发生碳水化合物氧化。糖尿病过程中，心肌病变之前会发生代谢重建；这些变化可能会导致心脏功能障碍。早期（发生心肌病变迹象之前）给予动物模型代谢调节剂治疗可改善其心脏功能。因此，明显，糖尿病性心肌病之前的代谢紊乱，不仅导致病理改变，也促进病变的发展。对于糖代谢，胰岛素通过其受体启动胰岛素受体细胞内底物的磷酸化。胰岛素受体底物家族作为停靠蛋白(docking protein)参与下游信号传导。白藜芦醇（3,5,4’-trihydroxystilbene）是一种多酚类化合物，富含于葡萄、食用和药用植物。有研究表明，白藜芦醇具有多种生化功能，包括抗氧化、抗癌、抗老化及抗炎症。也有研究表明，白藜芦醇对心脏缺血性损伤具有保护作用。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是一个广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶。GSK-3β对细胞具有多种生物学作用，如参与细胞信号转导、蛋白质合成、细胞增殖、分化、粘附和凋亡。在胰岛素作用下，GSK-3β也参与调节糖原代谢。 GSK-3α和GSK-3β为异构体，二者在代谢方面具有同等重要的作用。相对而言，GSK-3α在调节肝葡萄糖代谢和胰岛素敏感性方面作用较GSK-3β更为关键。而GSK-3β则主要调节骨骼肌（包括心脏）糖原合酶。与大多数蛋白激酶不同，去磷酸化的GSK–3为活化形；若其被蛋白激酶（如AKT）磷酸化则转变为无活性形。 AKT是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与各种细胞过程，如促进细胞存活、糖代谢，及细胞蛋白质合成。 AKT家族家庭成员也促进肝糖原合成。因此，在胰岛素作用下，活化的AKT通过磷酸化丝氨酸残基（Ser9）抑制GSK-3β活性，从而抑制糖原合成酶的作用。在糖尿病患者中，GSK-3β通过降低磷酸化程度而被激活。相反，通过增加AKT2磷酸化或心脏特异性过表达显性负效应（dominant negative）GSK-3β，可以造成GSK-3β失活并增加心肌对葡萄糖的利用和脂代谢。这些研究提示，GSK-3β和AKT2在心肌糖代谢中具有关键作用。本文目的为研究白藜芦醇能否保护糖尿病患者心脏的有害代谢变化，并确定白藜芦醇是否通过去活GSK-3β和激活AKT2而实现心脏保护作用。材料与方法动物模型30只雄性小白鼠（7至8周，30至35克）随机分为三组（每组10只），包括对照组、糖尿病组和糖尿病–白藜芦醇处置组。小鼠给予腹腔注射链脲佐菌素（SZT）5天（50毫克/公斤）。注射结束5天之后，从尾静脉采集全血分析血糖水平。若血糖水平连续3天超过15mmol/L则判定为糖尿病。对照组小鼠接受注射等体积柠檬酸钠缓冲液。糖尿病–白藜芦醇（>98％）处置组于STZ注射结束后第4天起，给予白藜芦醇灌胃（50毫克/公斤）处理45天。对照组和糖尿病组同期均接受同等体积水灌胃处理。Western blot分析总GSK-3β、Ser9磷酸化GSK-3β、总AKT2和磷酸化AKT2以Western blot分析。RNA提取和实时RT–PCR用于分析纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和细胞内粘附分子（ICAM-1）免疫组化分析用图像分析仪（Motic Images Advanced3.2image analyzer）分析三组切片的免疫组化变化。灰度值高表明pGSK-3β抗体阳性低。结果糖尿病组和糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠血糖水平糖尿病和糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠血糖水平均提高，直至实验终止（糖尿病发病后45天），表明STZ诱导成功。与糖尿病组相比，糖尿病–白藜芦醇处置组在糖尿病发病45天后血糖水平较低，但该差异无统计显著性（p>0.05）。总GSK-3β和磷酸化GSK-3β糖尿病发病后45天，三组小鼠心脏组织的总GSK-3β和磷酸化GSK-3β表达均以Western blot分析。与对照组相比，糖尿病组小鼠心脏组织的磷酸化GSK-3β水平显著增高（p <0.05）。与糖尿病组相比，糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠心脏组织的磷酸化GSK-3β水平显著降低。此外，进一步分析了三组小鼠心脏组织的磷酸化GSK-3β与总GSK-3β的比值（pGSK/GSK）。与其他两组相比，糖尿病组的pGSK/GSK比值显著增高（p <0.05）。总AKT2和磷酸化AKT2糖尿病发病后45天，以Western blot分析三组小鼠心脏组织的总AKT2和磷酸化AKT2（pAKT2）表达。与对照组相比，糖尿病组小鼠心脏组织的磷酸化AKT2水平显著降低（p <0.05）。与糖尿病组相比，糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠心脏组织中的磷酸化AKT2水平显著提高。此外，进一步分析了三组小鼠心脏组织的磷酸化AKT2水平与总AKT2GSK-3β水平的比值（pAKT2/AKT2）。结果发现，糖尿病组的pAKT2/AKT2比值比其他两组均显著降低（p <0.05）。实时RT-PCR检测炎性细胞因子糖尿病发病后45天，与糖尿病–白藜芦醇处置组相比，糖尿病组小鼠心脏组织的TNF–α、PAI-1和ICAM–1的mRNA表达水平均显著提高（p<0.05）。与对照组相比，糖尿病组小鼠的ICAM mRNA表达增加了4.2倍，而糖尿病–白藜芦醇处置组只增加了1.5倍。与对照组相比，糖尿病组的PAI-1mRNA表达增加了3.0倍，而糖尿病–白藜芦醇处置组只增加了0.8倍。此外，与对照组相比，糖尿病对照组的TNF-α的mRNA表达增加2.9倍，而糖尿病–白藜芦醇处置组只增加了0.6倍。磷酸化GSK-3β抗体的免疫组化分析以免疫组化方法研究了三组小鼠心脏组织中磷酸化GSK-3β抗体。对照组心肌细胞排列有序，且GSK-3β平均灰度值高。MOTIC图像分析显示其灰度级别为（+），对应相对灰度值162至169。糖尿病组心肌细胞排列紊乱，且GSK-3β的平均灰度值很低（灰度级别+++，对应相对灰度值92至104）。而糖尿病–白藜芦醇处置组的心肌细胞排列有序，且平均灰度值高的GSK-3β （灰度级别++，对应相对灰度值130至138）。讨论葡萄糖利用失调是1型和2型糖尿病的主要心脏问题，该失调可导致心功能障碍。本文研究了白藜芦醇对糖尿病性心损伤的保护作用，及其对GSK-3β和AKT2活性的影响。GSK-3β是糖代谢过程的限速酶，具有促进糖原沉积功能。在无胰岛素条件下，活性GSK–3使糖原合成酶磷酸化并负调控其活性，从而降低细胞合成和储存糖原的能力。此外，GSK-3β也参与细胞凋亡途径。研究发现，STZ诱导糖尿病小鼠的脑组织和患2型糖尿病人类患者的骨骼肌中GSK-3表达和活性显著增加。 AKT作为蛋白激酶参与糖代谢及其他细胞生物过程。如，AKT家族能促进肝糖原合成。白藜芦醇是一种多酚类化合物，并存在于食用植物中。有研究表明，白藜芦醇对心脏缺血性损伤具有保护作用。本研究发现，STZ诱导处理后，糖尿病和糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠表现出相似高血糖水平。这与近期研究中STZ在大鼠和小鼠上诱导糖尿病结果相符。我们用Western blotting分别分析了各组小鼠心脏组织中的总GSK-3β、磷酸化GSK-3β、总AKT2和磷酸化AKT2表达水平。结果显示，与较对照组小鼠相比，糖尿病组小鼠心脏组织中pGSK-3β活性显著增高，而pAKT2活性显著降低。然而，与糖尿病组小鼠相比，糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠心脏组织的pGSK-3β活性水平显著降低，而pAKT2活性显著提高。这些结果可能表明，白藜芦醇可能在某种程度上模仿GSK-3β促进磷酸化，从而降低pGSK-3β的活性水平。另一方面，白藜芦醇可抑制氧化应激，并清除糖尿病产生的自由基。因此，糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠表现出pAKT2活性增加，。心脏炎性细胞因子在糖尿病性心肌病的发病机制中具有关键作用。本研究实时PCR发现，与对照组相比，糖尿病小鼠的心脏组织中TNF–α、PAI-1和ICAM–1mRNA的表达增加约4倍。然而，糖尿病–白藜芦醇处置组的心脏组织中，该3个炎症因子的表达水平降低至糖尿病组小鼠的约1/3。此外，免疫组化分析显示，糖尿病–白藜芦醇处置组小鼠的心肌细胞排列有序且GSK-3β表达水平低，而糖尿病组小鼠则心肌细胞排列紊乱，且GSK-3β表达水平较高。这些结果表明，白藜芦醇及其对GSK-3β的去活作用和AKT2的激活作用对糖尿病性心肌病、炎症和纤维化具有明显的保护效果。此外，由于MPTP开放能导致氧化磷酸化解偶联从而介导心肌细胞死亡，白藜芦醇也可能通过抑制线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放来帮助心肌细胞抵抗糖尿病所致的氧化应激。线粒体通透性转换孔是线粒体内膜上的一种非特异性孔道。