周围神经损伤常引起病理性疼痛，表现为痛超敏，即痛阈显著下降；痛敏，即痛反应增强和自发性疼痛。多年来，尽管国内外已经进行了大量研究，但病理性疼痛的机制仍然不清楚。过去一直认为周围神经损伤后，感觉纤维在病理性疼痛的产生过程发挥关键作用。但近年来的研究发现神经损伤后病理性疼痛的产生和维持并不依赖于损伤的感觉纤维，邻近未损伤的神经纤维可能发挥了更为重要的作用。最近，有实验发现选择性切除大鼠腰5脊神经前根(lumbar5ventralroottransection，L5VRT)，而不损伤感觉神经元，也能产生类似于腰5脊神经结扎引起的病理性疼痛。但其机制有待于进一步研究。 本实验采用L5VRT模型，首先通过免疫荧光组织化学和免疫荧光双染，观察L5VRT后不同时间DRG和脊髓背角TNF-α以及TNFR1的表达及其组织学定位，然后使用TNF-α合成抑制剂thalidomide，抑制TNF-α的合成，观察TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛中的作用。实验最后还观察了L5VRT后p38在DRG和脊髓背角的激活，以及p38抑制剂对L5VRT引起痛觉过敏的影响。实验结果将有助于认识神经病理性疼痛产生的机制。 第1部分腰5前根切除引起肿瘤坏死因子-α及其受体在大鼠背根神经节和脊髓的表达 以往的实验发现TNF-α在神经病理性疼痛的产生过程发挥重要作用。选择性损伤大鼠运动神经纤维而保持初级感觉神经元的完整，也能引起痛觉过敏。但L5VRT后TNF-α在DRG和脊髓背角的表达仍不清楚。采用免疫荧光组织化学和免疫荧光双染技术，本实验首次详细、系统观察了L5VRT后，大鼠DRG和脊髓内TNF-α和TNFR1免疫活性变化的时间过程和表达的细胞类型。结果发现L5VRT能引起TNF-α和TNFR1在同侧L4、L5DRG和L5双侧脊髓背角表达增强。在DRG，与对照组相比，L5VRT后1d就可引起TNF-α和TNFR1在大鼠同侧L4和L5表达的显著增强(P＜0.01)，3d达到高峰(P＜0.001)，显著性差异可保持至术后2周左右。免疫双染结果显示，TNF-α免疫活性的增强主要发生在同侧L4和L5DRG的神经元和卫星样胶质细胞，DRG内浸润的单核-巨噬细胞和T-淋巴细胞也表达TNF-α。但是，TNFR1的上调则局限于神经元，特别是IB4阳性染色的C类神经元。在脊髓，L5VRT可引起L5双侧脊髓背角TNF-α和TNFR1明显上调。与假手术组比较，L5VRT后1d，同侧及对侧脊髓背角TNF-α和TNFR1免疫活性阳性面积百分比显著增加(P＜0.05)，7d达到高峰(P＜0.001)，并维持至术后2周作用。免疫双染发现TNF-α的上调既可见于胶质细胞，也可见于神经元，但是，TNFR1的表达主要发生在脊髓神经元。上述结果提示，选择性损伤脊神经运动纤维，可引起TNF-α和TNFR1在DRG和脊髓表达增强，而神经元可能是TNF-α释放后作用的主要靶点。 第2部分肿瘤坏死因子-α在腰5前根切除引起大鼠病理性疼痛中的作用 以往的实验发现TNF-α在周围神经损伤引起病理性疼痛的产生过程发挥重要作用，本实验第一部分已经发现L5VRT可引起TNF-α及其受体TNFR1在DRG和脊髓背角的明显上调，但TNF-α在选择性损伤运动神经纤维引起大鼠痛觉过敏中的作用仍不清楚。本实验以行为学测试为指标结合免疫荧光组织化学，观察了TNF-α合成抑制剂thalidomide对L5VRT引起大鼠病理性疼痛的作用。结果发现L5VRT可引起大鼠双侧后肢机械刺激和热刺激痛觉过敏，手术前2h腹腔注射thalidomide(50mg/kg)(n=8)，而后每天1次，持续7d，能完全阻断大鼠L5VRT后热刺激撤足潜伏期的下降，与注射溶剂组(n=6)比较，显著性差异从术后1d，一直保持至实验结束(2周)(P＜0.05)。然而接受thalidomide腹腔注射的大鼠，其50％机械刺激撤足阈值的变化经历了术后1-3d下降，而后逐渐恢复至正常的过程，与注射溶剂组相比，L5VRT后5d才出现显著性差异并维持到了实验结束(P＜0.05)。但是，如果于L5VRT后第7d腹腔注射thalidomide(50mg/kg)(n=6)，每天1次，至术后14d，对已经建立起来的大鼠机械刺激和热刺激痛觉过敏均无显著影响。与注射溶剂组(n=6)比较，从thalidomide治疗开始至实验结束机械刺激撤足阈值和热刺激撤足潜伏期均无显著性差异(P＞0.05)。免疫组织化学结果显示，无论是手术前给药组，还是手术后给药组，thalidomide都有效抑制了TNF-α在DRG和脊髓背角的合成。以上结果提示TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛的早期产生阶段发挥重要作用，但不参与对病理性疼痛的维持。 第3部分p38在大鼠背根神经节和脊髓背角的激活及其在腰5前根切除引起病理性疼痛中的作用虽然已有实验发现周围神经损伤和炎症能引起p38在DRG和脊髓背角的激活，而且应用p38抑制剂能缓解神经损伤引起的痛觉过敏，但选择性损伤运动纤维而保持DRG神经元的完整，是否也能导致p38在DRG和脊髓背角的激活，以及p38的激活在L5VRT引起病理性疼痛中的作用仍未见报道。本实验采用免疫荧光组织化学和免疫双染，首先观察了L5VRT后p38在大鼠DRG和脊髓背角的激活，然后通过鞘内注射p38抑制剂SB203580并结合行为学测试，进一步研究了p38激活在L5VRT引起病理性疼痛中的作用。结果发现，L5VRT能促进p38在同侧L5、L4DRG和L5脊髓的激活。与假手术组(n=6)比较，在DRG，L5VRT(n=6)后，磷酸化p38(phosphatedp38，p-p38)免疫活性阳性细胞百分比于术后1d明显升高(P＜0.05)，3d达到高峰(P＜0.01)，显著性差异可维持至术后3周左右。免疫荧光双染发现，p38的激活主要在DRG神经元，特别是IB4阳性染色的C类神经元。在脊髓，L5VRT能引起p38在L5双侧脊髓背角的激活，与假手术组(n=6)比较，L5VRT(n=6)能使p-p38免疫活性阳性面积百分比在术后1d明显增加(P＜0.05)，7d达到高峰(P＜0.001)，显著性差异持续到了术后14d。免疫双染发现，L5VRT后p38的激活主要局限于脊髓小胶质细胞。L5被根切除(lumbar5dorsalroottransection，L5DRT)能引起p38在同侧L5DRG的激活，但对L4DRG和脊髓无明显作用。表明脊髓p38的激活依赖于DRG神经元的持续兴奋。抑制TNF-α的合成，能明显抑制p38在DRG和脊髓背角的激活。手术前10min鞘内注射p38抑制剂(10μg/10μl)(n=8)，然后每天1次，持续14d，能完全阻断L5VRT引起的大鼠双侧后肢热刺激痛觉过敏和对侧机械刺激痛觉过敏，与注射溶剂组(n=6)比较，热刺激潜伏期及50％机械刺激撤足阈值，显著性差异从术后1d持续至治疗结束。而大鼠同侧后肢的机械刺激撤足阈值，在接受SB203580治疗后的1-3d显著下降，5d后明显升高(P＜0.05)，2周基本恢复至正常。但是，如果于L5VRT后第8d，鞘内一次性注射SB203580(10μg/10μl)(n=6)，对已经建立起来的大鼠痛觉过敏无明显作用。与L5VRT后第7d比较，接受SB203580治疗后6h、12h和24h，大鼠双侧后肢的机械刺激撤足阈值和热刺激撤足潜伏期均无显著性变化(P＞0.05)。以上结果提示运动神经纤维损伤可引起p38在DRG的激活，并可能通过增强DRG神经元的兴奋进一步引起p38在脊髓背角的激活，而p38的激活在L5VRT引起病理性疼痛的起始阶段发挥重要作用，但不参与病理性疼痛的维持。TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛中的作用可能是通过激活p38实现的。 结论1.选择性切除大鼠腰5脊神经前根，可引起TNF-α及其受体TNFR1在同侧L4、L5DRG和L5双侧脊髓背角表达增强。 2.L5VRT引起的TNF-α表达增强，在DRG可见于神经元及卫星样胶质细胞，在脊髓背角也发现于胶质细胞和神经元。但TNFR1的上调仅存在于DRG和脊髓背角神经元。 3.TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛的早期产生阶段发挥重要作用，但不参与对L5VRT后病理性疼痛的维持。 4.L5VRT可引起p38在同侧L4、L5DRG和L5双侧脊髓背角的激活。在DRG，p38主要激活于神经元，而在脊髓，p38的激活仅发现于小胶质细胞。 5.L5DRT能引起p38在同侧L5DRG的激活，但对L4DRG和L5脊髓背角无明显作用。 6.P38的激活在L5VRT引起病理性疼痛的产生阶段发挥重要作用，但不参与对病理性疼痛的维持。 7.TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛中的作用可能与激活p38有关。