牙周炎导致的牙周骨的缺损是口腔临床亟需解决的问题，组织工程技术的应用为牙周骨缺损修复带来希望。组织工程包括种子细胞、支架材料和生长因子三大要素。种子细胞与支架材料的黏附是二者相互作用的第一步，在体内，细胞的黏附活动受到细胞表面的整合素等细胞黏附分子及存在于胞外基质中的黏附蛋白的调节；在体外，细胞的黏附受到胞外环境的影响，尤其是生物支架材料表面的性能的影响。深入了解在细胞黏附过程中，黏附分子的参与调节及其作用，对生物材料表面进行修饰和改性，有效地提高细胞对材料的黏附能力，促进细胞的增殖和诱导细胞的分化，是组织工程生物支架材料面临的挑战。　　 本课题拟对骨髓基质细胞进行培养和富集，采用扫描电镜及激光共聚焦扫描显微镜观察BMSCs对改性材料表面黏附过程中的形态学变化，利用基因分析技术探讨BMSCs与MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附的基因调控机制，对细胞与材料整合过程中黏附分子之间的调控作用进行系统深入的研究；并对基因分析中差异表达的基因进行功能分析，筛选出对初始黏附活动起重要作用的基因，阐明BMSCs与MPEG-PLLA-PLL聚合膜初始黏附过程的分子机制，为促进细胞黏附的新材料的研制和牙体牙周组织再生提供实验依据。　　 第一章 MPEG和PLL对BMSCs初始黏附中的作用　　 目的：通过观察BMSCs对MPEG-PLLA和PLLA-PLL两种聚合膜表面的黏附，探讨表面改性基团MPEG和PLL对BMSCs黏附行为的影响。　　 方法：取第2-6代原代培养BMSCs，接种至PLLA、MPEG-PLLA和PLLA-PLL三种聚合膜和TCP(组织细胞培养板)表面，分别在DMEM和10％FBS DMEM两种不同条件下连续培养1小时，定量检测黏附细胞；分别对培养1小时、2小时和24小时的细胞进行扫描电镜观察；对培养1小时和24小时的细胞进行细胞骨架蛋白染色，激光共聚焦扫描显微镜观察。　　 结果：黏附细胞定量检测结果显示，与TCP比较，DMEM培养条件下，MPEG-PLLA和PLLA-PLL两组聚合膜细胞黏附量均增高；10％ FBS DMEM培养条件下，两组聚合膜细胞黏附量均降低。与PLLA比较，DMEM培养条件下，MPEG-PLLA聚合膜细胞黏附量增高，MPEG17-PLLA94和MPEG17-PLLA56聚合膜组份细胞黏附量明显增高；10％ FBS DMEM培养条件下，MPEG-PLLA聚合膜细胞黏附量无明显改变。在两种培养条件下，与PLLA比较，PLLA-PLL聚合膜细胞黏附量均随改性基团PLL含量升高而增高，PLLA77-PLLA72聚合膜组分明显增高，当PLL增高到一定程度(PLLA160-PLL245)，细胞黏附量下降。　　 扫描电镜结果显示，连续培养1小时，PLLA聚合膜上细胞胞体小，形态呈球形，伸出大量细长的伪足，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上细胞呈圆饼状，细胞边缘较厚，TCP表面的细胞扁平舒展，细胞边缘与材料贴附；连续培养2小时，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上细胞胞体增大，并向聚合膜表面伸出较多伪足。连续培养24小时，细胞移行伸展成梭形，各材料表面细胞形态接近。　　 激光共聚焦扫描电镜观察结果显示，连续培养1小时，PLLA聚合膜上细胞骨架蛋白成环状分布于细胞边缘，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上细胞骨架蛋白成点状、环状或细丝状贯穿分布与胞浆中；连续培养24小时，PLLA聚合膜上细胞骨架蛋白分布稀疏，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上细胞骨架蛋白大量表达，排列有序。　　 结论：改性基团MPEG和PLL能直接促进BMSCs的黏附：MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜促进BMSCs的黏附；细胞形态学结果进一步证实了这一结论。　　 第二章 MPEG-PLLA-PLL表面改性聚合膜对BMSCs初始黏附的影响　　 目的：通过对MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面BMSCs黏附情况的观察和聚合膜蛋白吸附定量分析，初步探讨MPEG-PLLA-PLL对BMSCs初始黏附的影响和作用机制。　　 方法：取第2-6代原代培养BMSCs，接种至PLLA、MPEG-PLLA和四组MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面，分别在DMEM和10％ FBS DMEM两种不同培养条件下连续培养1小时，定量检测黏附细胞总数；分别对连续培养1小时、2小时和24小时的细胞进行扫描电镜观察及细胞面积定量分析；连续培养1小时和24小时后，细胞骨架蛋白染色，激光共聚焦显微镜观察；全血清孵育聚合膜24小时，定量检测材料表面吸附的血清蛋白。　　 结果：对四组改性基团比例不同的MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附细胞定量检测发现，与PLLA比较，在DMEM和10％ FBS DMEM两种培养条件下，四组聚合膜中MPEG-PLLA-PLL聚合膜细胞黏附量增高；同组聚合膜内，细胞黏附量均随着PLL含量的升高而增高，当PLL增高至一定程度时，细胞黏附量下降。与TCP比较，在两种培养条件下，MPEG17PLLA94PLL107和MPEG17PLLA160PLL162聚合膜组份细胞黏附量均高于TCP。　　 扫描电镜结果显示，MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表面，细胞扁平舒展，大量膜状扁平伪足从细胞边缘伸出，PLLA聚合膜上细胞呈球形，大量细长指突状伪足从细胞边缘伸出。面积定量分析结果表明，MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP上细胞舒展面积大于PLLA，差异有统计学意义。MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上细胞面积的变化与PLLA比较无统计学差异。　　 激光共聚焦扫描显微镜结果显示，细胞连续培养1小时，MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表向细胞骨架蛋白表达丰富，排列清晰；PLLA聚合膜表面细胞骨架蛋白呈环状或点状，不均匀分布于细胞边缘及胞浆中；连续培养24小时，MPEG-PLLA-PLL和TCP表面细胞骨架蛋白表达丰富，排列清晰有序，大量骨架蛋白丝越过细胞核贯穿整个细胞；PLLA表面，骨架蛋白主要分布于细胞边缘，表达稀疏。　　 蛋白吸附定量分析结果显示，与空白对照比较MPEG-PLLA-PLL聚合膜血清蛋白吸附量无明显变化，PLLA和MPEG-PLL两种聚合膜上血清蛋白吸附量升高。　　 结论：MPEG-PLLA-PLL聚合膜不受培养环境中血清的影响，能促进BMSCs的黏附；MPEG-PLLA-PLL聚合膜通过降低培养环境中非特异性蛋白的吸附促进BMSCs的黏附。　　 第三章 MPEG-PLLA-PLL聚合膜细胞毒性实验　　 目的：通过对成骨细胞在聚合膜表面生长情况的观察及细胞膜完整性的检测，探讨聚合膜体外细胞毒性。　　 方法：取第6-8代体外培养的成骨细胞，接种至PLLA、MPEG-PLLA、MPEG-PLLA-PLL、MPEG-PLLA-PLL+Br等聚合膜和TCP表面，连续培养24小时，检测培养基中LDH的浓度，判断细胞膜的完整性；连续培养3天和7天，对聚合膜表面的成骨细胞进行结晶紫染色，倒置相差显微镜观察。　　 结果：LDH检测结果显示，PLLA、MPEG-PLLA和MPEG-PLLA-PLL聚合膜细胞培养上清与TCP比较，OD值无明显变化(p>0.05)；MPEG-PLLA-PLL+Br聚合膜细胞培养上清OD值明显增高(p<0.05)。分别连续培养3天和7天，结晶紫染色显示PLLA、MPEG-PLLA、PLLA-PLL、MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表面细胞大量生长，MPEG-PLLA-PLL+Br聚合膜仅残留细胞残片。　　 结论：经过对PLLA，MPEG-PLLA，PLLA-PLL和MPEG-PLLA-PLL聚合膜体外实验未显示聚合膜细胞毒性。　　 第四章BMSCs与MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附机制基因分析　　 目的：通过对BMSCs与MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附过程中，相关黏附基因表达分析，探讨MPEG-PLLA-PLL聚合膜对BMSCs黏附过程中的影响机制。　　 方法：取第2-4代原代培养BMSCs，接种至PLLA、MPEG17-PLLA94和MPEG17-PLLA94-PLL107聚合膜和TCP表面连续培养24小时，收集各聚合膜和TCP上黏附的细胞，提取总RNA，利用SuperArray RT2 PCR试剂盒，采用Reversetranscription PCR及Realtime PCR技术，对与细胞初始黏附相关的84个黏附基因的表达情况进行定量分析。　　 结果：通过对MPEG-PLLA-PLL/PLLA、 MPEG-PLLA-PLL/TCP、MPEG-PLLA/PLLA、MPEG-PLLA/TCP、MPEG-PLLA/MPEG-PLLA-PLLA、PLLA/TCP每两种材料表面细胞黏附基因表达进行对比分析发现，共有26个基因改变有统计学意义，与PLLA聚合膜和TCP比较，MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面10个基因表达上调，2个基因表达下调：与MPEG-PLL聚合膜比较，MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面6个基因表达上调，1个基因表达下调。变化活跃的基因有CDH1、COL16A1、ITGB2、ITGAL、ITGAM、LAMA1、LAMA3、MMP3、MMP7、MMP13等基因。　　 结论：MPEG-PLLA-PLL聚合膜通过上调胶原蛋白、整合素、钙粘连蛋白、层粘连蛋白和基质金属蛋白酶等基因的表达，促进BMSCs在其表面的黏附和伸展。