目的 凋亡抑制基因survivin(SVV)自1997年发现以来即引起了国内外学者的广泛关注。大量研究阐明了其高表达与肿瘤的相关性，SVV基因也被认为是可靠的肿瘤标志物。但其在人类恶性肿瘤发生、发展中的生物学功能尚未阐明。国内外也尚未见有自胃癌细胞中克隆SVV基因的报道。因此，我们拟从人胃癌细胞中克隆SVV基因，并研究其在胃癌发生发展过程中的生物学作用。 方法 1．RT-PCR技术自人胃癌细胞SGC7901中克隆Survivin基因。 2．将所获片段克隆入pGEN T-Easy载体，EcoR I酶切鉴定。分析插入片段的序列，通过BLASTN、BLASTP与GeneBank数据库进行同源性比较，确定所获SVV基因克隆的正确性。 3．将经过测序证实的SVV片段两端加入限制性内切酶Nde I和BamH I识别位点，并克隆入原核表达载体pRSET，实现其在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。 4．根据所获SVV片段序列设计引物，扩增得到相应的正向SVV序列(SW-a)及反向SVV序列(SVV-b)，两端分别引入限制性内切酶EcoR I和BamH I识别位点，克隆入真核表达载体pEGFP-N1。 5．将含SVV正向序列的阳性重组子克隆瞬时转染人胃癌细胞SGC7901。激光共聚焦技术检测SVV基因转染胃癌细胞后的细胞内定位。 解放军总医院 博士学位论文 军医进修学院 人胃癌中Survivin基因的克隆与功能研究 6．将重组子克隆稳定转染人胃癌细胞SGC7901、MI｛N45和小鼠NIH3T3细胞。 对于经过G418筛选的阳性转染细胞克隆，检测其转染前后的细胞生长曲 线、细胞增殖周期的改变；TUN’EL技术检测细胞凋亡的变化；免疫组化技 术检测PCNA表达的改变；MI7法检测对化疗药物5－u、VP16的敏感性改 变等。 7．根据SW片段序列设计特异性引物，采用RT－PCR方法对5例胃癌、l例肝 癌标本及白血病细胞HL60、结肠癌细胞HT29进行检测。 8．用原位杂交分析SW基因两种剪切形式SA与S凸在胃癌、结肠癌、前列 腺癌、肺癌及乳腺癌等组织中的表达，标本为进展期胃癌手术标本的石蜡 包埋组织61例、结肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌手术或活检标本的石 蜡包埋组织各2例。采用图像分析软件，以平均光密度值为指标，量化 SW基因在不同组织的表达程度。 结果 1．获得人SW基因的全长CDNA片段一S4A。 2．经序列测定、核昔酸序列比对，证实所获片段批与SW基因己知序列完 全一致。同时，得到一较印 少11 gbP的片段－SS，经BLASTN． BLASTP与 GeneBank数据库进行同源性比较，表明S刀较SW完整序列缺失第三个外 显子，编码137个氨基酸的蛋白质。该蛋白质的氨基酸序列与SW基因的 蛋白质产物高度同源，故称SS为SW基因的变异体。 3．实现了 SW基因在大肠杆菌 BLZI（DE3）中的高效表达。 4．经测序证实，SW基因的正向与反向序列正确地克隆入真核表达载体 pEGFP－NI，分别命名为pEGFP－NISVV－－a和pEGFP－NISW－b。 4 解放军总医院 博士学位论文 军医进修学院 人胃癌中Survivin基因的克隆与功能研究 5．含SW基因正向序列的阳性重组子瞬时转染人胃癌细胞SGC7901后，激光 共聚焦显示，SW基因转染成功，并且表明，SW基因在胃癌细胞的细胞浆 中表达。 6．含SW基因正向与反向序列的阳性重组子转染人胃癌细胞SGC7901、Wb45 及小鼠叮H盯3细胞（Nm3H细胞仅转染含正向SW片段的重组子），经 G4筛选获得阳性转染细胞克隆。上述稳定转染细胞的生长曲线观察显 示：转染SW正向序列即pEGFPWI－SVV－a者，细胞的生长速度明显快于转 染空载体P巳干PNI者，而转染反向序列PEGFPWI－SW－b者，其细胞生长 速度则减慢；细胞增殖周期检测显示：转染pEGFP－NISVV－－a者，出现GW 和／或 S期细胞比例的增加，而转染 PEGFP－NISVV－－b者则表现为 GW和／或 S期细胞比例的减少；T［JNEL技术检测转染前后细胞凋亡与免疫组化检测 PCNA表达均未发现显著的变化。fIT法检测转染SW基因前后的体外药物 敏感实验也未发现显著变化。 7．根据SW基因序列设计特异性引物，RT－PCR结果显示，SW基因在5例人 胃癌