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在日常生活中，受伤流血事件时有发生，而不受控制的出血是军事战争与意外事故中造成死亡的重要因素。在大量失血之前若能迅速实现血液的凝结，可为抢救患者争取宝贵时间。角蛋白作为一种天然来源的生物材料，近年来因其良好的止血性能备受关注。然而，由于当前常用的角蛋白提取物为复合物，其止血机制研究一直停滞不前。蛋白质的生物活性与其结构密切相关，本课题基于重组蛋白组分单一、纯度高的特点，对人发角蛋白的不同结构域进行重组表达并比较其止血性能差异，通过探究人发角蛋白止血性能与其结构的关系初步解析其止血机制。
不同类型的重组角蛋白（Recombinant Keratin,RK）。包括Ⅰ型和Ⅱ型的全序列重组角蛋白（RK31、RK37、RK81和RK86）、中央杆状功能（Rod）区域（RK31-Rod、RK37-Rod、RK81-Rod和RK86-Rod）和α螺旋区域(RK37-1Aα、RK37-1Bα、RK37-2α、RK81-1Aα、RK81-1Bα和RK81-2α)，并通过浸涂法制备了纳米纤维复合膜用于体内外止血性能的评价。此外，基于前期文献报道角蛋白的止血机制可能与纤维蛋白原相互作用有关，本课题考察了不同结构域重组角蛋白对血浆复钙时间、纤维蛋白聚合以及纤维蛋白肽释放等影响，初步研究了人发角蛋白不同结构域与止血性能的关系。
本文主要的研究内容和结果：
①首先对4种全序列角蛋白RK31、RK37、RK81和RK86进行重组表达与纯化，并对其理化性质进行表征。SDS-PAGE结果中的单一目的条带表明所获得的重组角蛋白具有纯度高特点，MALDI-TOF-MS分析表明角蛋白的分子量与理论预测值一致。观察全序列角蛋白的UV-Vis图谱发现在280nm附近有最大吸收值，与人发角蛋白提取物的数据一致。此外，重组角蛋白的FT-IR图谱中发现了角蛋白的特征吸收峰，证明了两者化学结构基本相似；而CD图谱分析表明重组角蛋白主要是由α-螺旋结构组成。
②利用静电纺丝技术将聚己内酯（PCL）制备成纳米纤维，进而将全序列重组角蛋白溶于甲酸溶液后浸涂在PCL纤维表面制备重组角蛋白复合膜，并对其进行表面形貌和化学结构分析。SEM观察发现纳米纤维分布均匀，重组角蛋白浓度为2mg/mL时可获得均匀的蛋白涂层。FT-IR分析结果发现复合膜在图谱中出现角蛋白的特征峰，且在1500-1750cm-1之间的峰面积有所增加，证明了重组角蛋白成功的涂敷在PCL表面上。此外，通过体内外凝血实验考查纳米纤维复合膜的止血效果。体外凝血实验结果表明，与PCL纳米纤维组相比，重组角蛋白复合膜的体外凝血指数（Blood Clotting Index,BCI）显著降低，证明了加入角蛋白后，血红蛋白的凝结率增大，RK31/PCL，RK37/PCL，RK81/PCL，RK86/PCL在体外均有显著的凝血作用。而大鼠肝脏损伤和股动脉损伤实验结果表明，RK31/PCL，RK37/PCL，RK81/PCL，RK86/PCL组相对于空白组都能缩短出血时间，减少失血量。
③基于角蛋白的结构，分别选取Ⅰ型和Ⅱ型人发角蛋白的中央杆状功能（Rod）区域（RK31-Rod、RK37-Rod、RK81-Rod和RK86-Rod）和α螺旋区域(RK37-1Aα、RK37-1Bα、RK37-2α、RK81-1Aα、RK81-1Bα和RK81-2α)进行重组表达，并通过制备的复合膜对人发角蛋白不同结构域的止血性能进行评价。理化性质分析结果显示，Rod区域和α螺旋区域的重组蛋白也具有较高的纯度，FT-IR、UV以及CD图谱与全序列重组角蛋白一致。而通过对不同结构域重组蛋白复合膜的润湿性测试，发现随着角蛋白的加入亲水性增加，并且亲水性α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，表明角蛋白的头（Head）和尾(Tail)区域对蛋白的疏水性影响较大。此外，体内外止血实验也表明止血性能排序为：α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，表明α螺旋结构是人发角蛋白止血的关键部位，随着不规则卷曲在蛋白中增加，其止血性能呈现下降趋势，其中第一个α螺旋的止血性能最为突出，第二、三个α螺旋区域之间止血性能差异不明显。
④基于前期文献报道人发角蛋白的止血机制可能与纤维蛋白原相互作用有关。本课题对不同结构域的重组蛋白进行了血浆复钙时间分析、血小板黏附分析、股动脉MSB纤维蛋白染色分析、透射电子显微镜分析、高效液相色谱实验，结果发现，随着角蛋白的加入血小板被激活的数量增加，其数量高低顺序为：α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，其中角蛋白的3个α螺旋区域激活的血小板数量差别并不明显，表明角蛋白的不同结构域可激活血小板，促使形成血栓，提高止血速率。此外，角蛋白还可以促进纤维蛋白肽FpA与FpB的释放以及纤维蛋白的形成，强弱顺序依然为：α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，表明角蛋白会促进纤维蛋白原转变成纤维蛋白的过程，达到快速止血效果。
综上所述，本课题基于角蛋白的结构分别表达了全序列、Rod区域和α螺旋区域重组角蛋白，发现随着α螺旋在重组蛋白中比例升高，可显著缩短止血时间和降低失血量，止血效率提高。表明α-螺旋结构是人发角蛋白止血的关键区域。此外，通过不同结构域重组角蛋白与血小板和纤维蛋白原的作用，证明人发角蛋白的α螺旋结构可激活血小板，同时还可以促进纤维蛋白的聚合，以及加快短肽FpA和FpB的释放速率，初步探究了人发角蛋白不同结构与止血性能的关系。本研究为新型止血敷料的开发和设计提供了实验和理论基础。
不同类型的重组角蛋白（Recombinant Keratin,RK）。包括Ⅰ型和Ⅱ型的全序列重组角蛋白（RK31、RK37、RK81和RK86）、中央杆状功能（Rod）区域（RK31-Rod、RK37-Rod、RK81-Rod和RK86-Rod）和α螺旋区域(RK37-1Aα、RK37-1Bα、RK37-2α、RK81-1Aα、RK81-1Bα和RK81-2α)，并通过浸涂法制备了纳米纤维复合膜用于体内外止血性能的评价。此外，基于前期文献报道角蛋白的止血机制可能与纤维蛋白原相互作用有关，本课题考察了不同结构域重组角蛋白对血浆复钙时间、纤维蛋白聚合以及纤维蛋白肽释放等影响，初步研究了人发角蛋白不同结构域与止血性能的关系。
本文主要的研究内容和结果：
①首先对4种全序列角蛋白RK31、RK37、RK81和RK86进行重组表达与纯化，并对其理化性质进行表征。SDS-PAGE结果中的单一目的条带表明所获得的重组角蛋白具有纯度高特点，MALDI-TOF-MS分析表明角蛋白的分子量与理论预测值一致。观察全序列角蛋白的UV-Vis图谱发现在280nm附近有最大吸收值，与人发角蛋白提取物的数据一致。此外，重组角蛋白的FT-IR图谱中发现了角蛋白的特征吸收峰，证明了两者化学结构基本相似；而CD图谱分析表明重组角蛋白主要是由α-螺旋结构组成。
②利用静电纺丝技术将聚己内酯（PCL）制备成纳米纤维，进而将全序列重组角蛋白溶于甲酸溶液后浸涂在PCL纤维表面制备重组角蛋白复合膜，并对其进行表面形貌和化学结构分析。SEM观察发现纳米纤维分布均匀，重组角蛋白浓度为2mg/mL时可获得均匀的蛋白涂层。FT-IR分析结果发现复合膜在图谱中出现角蛋白的特征峰，且在1500-1750cm-1之间的峰面积有所增加，证明了重组角蛋白成功的涂敷在PCL表面上。此外，通过体内外凝血实验考查纳米纤维复合膜的止血效果。体外凝血实验结果表明，与PCL纳米纤维组相比，重组角蛋白复合膜的体外凝血指数（Blood Clotting Index,BCI）显著降低，证明了加入角蛋白后，血红蛋白的凝结率增大，RK31/PCL，RK37/PCL，RK81/PCL，RK86/PCL在体外均有显著的凝血作用。而大鼠肝脏损伤和股动脉损伤实验结果表明，RK31/PCL，RK37/PCL，RK81/PCL，RK86/PCL组相对于空白组都能缩短出血时间，减少失血量。
③基于角蛋白的结构，分别选取Ⅰ型和Ⅱ型人发角蛋白的中央杆状功能（Rod）区域（RK31-Rod、RK37-Rod、RK81-Rod和RK86-Rod）和α螺旋区域(RK37-1Aα、RK37-1Bα、RK37-2α、RK81-1Aα、RK81-1Bα和RK81-2α)进行重组表达，并通过制备的复合膜对人发角蛋白不同结构域的止血性能进行评价。理化性质分析结果显示，Rod区域和α螺旋区域的重组蛋白也具有较高的纯度，FT-IR、UV以及CD图谱与全序列重组角蛋白一致。而通过对不同结构域重组蛋白复合膜的润湿性测试，发现随着角蛋白的加入亲水性增加，并且亲水性α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，表明角蛋白的头（Head）和尾(Tail)区域对蛋白的疏水性影响较大。此外，体内外止血实验也表明止血性能排序为：α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，表明α螺旋结构是人发角蛋白止血的关键部位，随着不规则卷曲在蛋白中增加，其止血性能呈现下降趋势，其中第一个α螺旋的止血性能最为突出，第二、三个α螺旋区域之间止血性能差异不明显。
④基于前期文献报道人发角蛋白的止血机制可能与纤维蛋白原相互作用有关。本课题对不同结构域的重组蛋白进行了血浆复钙时间分析、血小板黏附分析、股动脉MSB纤维蛋白染色分析、透射电子显微镜分析、高效液相色谱实验，结果发现，随着角蛋白的加入血小板被激活的数量增加，其数量高低顺序为：α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，其中角蛋白的3个α螺旋区域激活的血小板数量差别并不明显，表明角蛋白的不同结构域可激活血小板，促使形成血栓，提高止血速率。此外，角蛋白还可以促进纤维蛋白肽FpA与FpB的释放以及纤维蛋白的形成，强弱顺序依然为：α螺旋区域蛋白＞Rod区域蛋白＞全序列蛋白，表明角蛋白会促进纤维蛋白原转变成纤维蛋白的过程，达到快速止血效果。
综上所述，本课题基于角蛋白的结构分别表达了全序列、Rod区域和α螺旋区域重组角蛋白，发现随着α螺旋在重组蛋白中比例升高，可显著缩短止血时间和降低失血量，止血效率提高。表明α-螺旋结构是人发角蛋白止血的关键区域。此外，通过不同结构域重组角蛋白与血小板和纤维蛋白原的作用，证明人发角蛋白的α螺旋结构可激活血小板，同时还可以促进纤维蛋白的聚合，以及加快短肽FpA和FpB的释放速率，初步探究了人发角蛋白不同结构与止血性能的关系。本研究为新型止血敷料的开发和设计提供了实验和理论基础。