RanBPM对BDNF促神经元形态发生和存活的调节作用及其机制研究

来源 :山东大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:a574150767
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脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子家族的重要成员,在脊椎动物神经系统中发挥着重要作用。BDNF受体可分为两类:低亲和力的p75神经营养因子受体(p75NTR)和高亲和力的TrkB酪氨酸激酶受体。研究表明,BDNF对机体的生物学作用主要通过TrkB受体实现。BDNF与TrkB受体结合后,受体胞内域的酪氨酸残基被激活,继而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)信号通路和磷脂酶C-y(phospholipase C-Y,PLC-Y)信号通路等一系列胞内信号转导途径,从而介导BDNF的生物学功能。   RanBPM(Ran-binding protein in the microtubule-organizing center,也称为RanBP9)广泛分布于哺乳动物体内几乎所有的组织中,尤其在心、脑和肾中有相对较高的表达量。RanBPM具有跟多种分子结合的特性,被认为是一种支架分子。此外,RanBPM能够与细胞表面受体MET,LFA-1,L1,Axl/Sky和Plexin-A等结合,参与不同的细胞内信号通路。   尽管RanBPM已经被证实能够与p75NTR和NGF受体TrkA结合,但是RanBPM在神经营养因子介导的生物学功能上的作用目前还不清楚。因此,在该研究中,我们主要解决3个层次的问题:首先,RanBPM是否能够与哺乳动物中枢神经系统中表达最丰富的神经营养因子受体TrkB结合?其次,如果二者能够结合,RanBPM是否能够参与BDNF介导的TrkB下游信号通路?最后,RanBPM是否能够参与BDNF/TrkB介导的生物学功能,如神经元的形态发生与存活?   1.各种表达质粒的构建   2.大鼠RanBPM siRNA质粒的构建及敲除效率的测定   3.大鼠海马神经元的原代培养及免疫荧光细胞化学染色   4.免疫共沉淀及Western blot   5.PC12稳定表达TrkB的细胞系(PC1210细胞系)的构建   6.BDNF介导的TrkB、TrkBY515磷酸化程度及信号分子MAPK、Akt活化程度检测   7.评估PC1210细胞分化与海马神经元树突形态发生的检测方法   8.评估PC1210细胞凋亡的检测手段   1、证实RanBPM是一种新发现的与TrkB结合的蛋白   我们首先构建了带有HA标签的人类RanBPM cDNA的真核表达质粒(pcDNA3.1-HA-hRan BPM)和带有Flag标签的大鼠TrkB cDNA的真核表达质粒(pcDNA3.1-Flag-rTrkB)。然后通过免疫共沉淀和免疫荧光细胞化学的方法,证实RanBPM和TrkB能够相互结合,并且两者在亚细胞水平有一致的定位。   2、证实TrkB酪氨酸激酶区与RanBPM结合   我们首先构建了缺失TrkB不同区域的突变体:△CT(缺失C末端)和△TK(缺失酪氨酸激酶区和C末端),通过免疫共沉淀的方法证明RanBPM与TrkB△CT结合,但不与TrkB△TK结合。随后,我们构建了突变体TrkB.T1(体内存在的TrkB的一种截短的形式,胞内区只含有近膜区的一点点)和T1TK(将酪氨酸激酶区嫁接到TrkB.T1上),并证实RanBPM不能与TrkB.T1结合,但能够与T1TK结合。   3、证实TrkB的激酶活性对二者结合的重要性,NT4和BDNF都能够促进TrkB与RanBPM结合   Trk抑制剂K252a能够减弱RanBPM与TrkB的结合。RanBPM与丧失激酶活性的TrkB.KD的结合程度更弱。然而,TrkB的两种配体NT4(30ng/ml)和BDNF(30 ng/ml)都能够显著增加TrkB/RanBPM的结合能力。   4、RanBPM不影响BDNF介导的TrkB和TrkBY515磷酸化,但参与调节BDNF介导的MAPK和PI3K信号转导   研究证实:与相应的对照组相比,过表达RanBPM和敲除RanBPM都不影响BDNF介导的TrkB和TrkBY515磷酸化。而与转染pcDNA3.1空载体的对照组相比,过表达RanBPM能够促进BDNF介导的信号分子MAPK和Akt的活化,并且这种作用是RanBPM剂量依赖的;敲除掉内源性RanBPM之后,与对照siRNA相比,BDNF介导的MAPK和Akt的活化程度都有所降低;此外,RanBPM参与调节MAPK短时程和长时程两种信号转导方式。   5、RanBPM促进BDNF介导的神经元形态发生   与转染pcDNA3.1空载体的对照组相比,过表达RanBPM能够促进BDNF介导的PC1210细胞分化程度,包括分化比例的增加和平均最长突起长度的增加;此外,过表达RanBPM能够增加BDNF介导的海马神经元总的树突数目和总的突起长度。敲除掉内源性RanBPM之后,BDNF介导的PC1210细胞分化程度和海马神经元形态发生程度都受到抑制。   6、RanBPM增强BDNF在血清剥夺引起的细胞凋亡方面的保护作用   在加入BDNF情况下,与转染pcDNA3.1空载体的对照组相比,过表达RanBPM组中血清剥夺引起的细胞凋亡数目明显减少;而敲除内源性RanBPM后,细胞凋亡数目较对照siRNA组明显增加,这说明RanBPM能够参与BDNF在血清剥夺引起的细胞凋亡方面的保护作用。   支架蛋白RanBPM通过与TrkB酪氨酸激酶区域的相互作用参与调节BDNF介导的TrkB下游两条主要的信号途径--MAPK和PI3K信号通路,并由此参与BDNF/TrkB介导的神经元形态发生与细胞存活等生物学功能。
其他文献
地衣是真菌与藻类共生组成的生命体,分类学上由其共生菌-地衣型真菌命名。地衣是一种宽生态幅生物,可适应多种极端生境。地衣体中次生代谢产物种类丰富,大部分为地衣所特有,具有多种生物活性。地衣附生真菌是指生长于地衣菌丝体内的真菌,也称地衣内生真菌。近年来研究发现地衣内生真菌同样具有丰富的活性次生代谢产物。本论文对地衣及地衣内生真菌次生代谢产物进行了初步研究。首先对比了刮皮层法与YAMAMOTO法两种地衣