Gly-Gln是一种由β内啡肽转录后加工而形成的内源性二肽，具有多种生物学活性，如调节机体免疫功能、改善小肠结构和吸收功能、抑制IL-1β和前列腺素E(2)的产热等，在畜禽营养调控方面具有潜在的应用价值。但由于缺乏合适的大规模生产工艺，Gly-Gin的应用研究受到极大限制。 本试验采用生物工程方法，设计并制备出含有多个Gly-Gin二肽的核苷酸序列Gn，并利用同尾酶技术将该序列串联构建成Gn 12聚体重组质粒pR-12Gn。将该12聚体核苷酸序列转移到大肠杆菌pET表达系统上，以融合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。表达产物经纯化后，通过饲养试验检测了其对小鼠生长及免疫机能的影响。 1、pR-12Gn重组质粒的构建 根据大肠杆菌偏爱密码子合成了含特异胰蛋白酶和胃蛋白酶酶切位点的Gly-Gln二肽核苷酸序列Gn，并克隆至pRSET A质粒中，采用串联重复策略获得pR-12Gn重组质粒，测序结果证明，pR-12Gn重组质粒核苷酸序列和阅读框架与设计序列完全一致。 2、Gn多聚体的表达和纯化 将pR-12Gn中的Gn多聚体核苷酸序列克隆到pET32 a质粒上，获得原核表达载体pET-12Gn，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经阳性克隆检测并测序证明序列正确后，在IPTG诱导下进行蛋白表达。在30℃，50μg/ml Amp浓度和0.1 mM IPTG诱导下过夜表达，所表达的目的蛋白分子量约为40 kDa，与预期值相符，目的蛋白表达量占总蛋白的40％左右，其中可溶性蛋白占32％。细菌蛋白经50％Ni-IDA树脂纯化，可获得纯度达95％的目的蛋白。纯化后的目的蛋白经透析去除咪唑并浓缩备用。 3、Gn多聚体蛋白的生物活性检测 选用120只3周龄断奶雄性清洁级昆明小鼠(KM)，按体重相近原则将小鼠随机分成4组：目的蛋白组、纯Gly-Gin组、空质粒组和对照组。分别通过喷涂方法在每公斤饲料中添加2.67 g未纯化的目的蛋白、0.21g Gly-Gin二肽、2.67 g空质粒表达蛋白和等量的水。进行28天的饲养试验，每周称重。试验结束时采集血样，测定脾脏、肝脏、心脏、肾脏和腹脂的器官指数，并检测肝脏和血液中甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)水平。每组取4只小鼠用MTT法检测血液和脾脏T、B淋巴细胞的转化率。 结果表明，饲料中添加目的蛋白和Gly-Gin二肽均能够显著增加小鼠肝脏指数，同时显著降低肝脏中的胆固醇含量，但对小鼠体重均无显著影响。目的蛋白和Gly-Gin二肽对小鼠T、B淋巴细胞的增殖都表现出一定的抑制效应。为进一步研究目的蛋白对小鼠免疫功能的影响，试验选用48只3周龄雄性健康昆明小鼠，按体重相近原则将小鼠随机分成4组：目的蛋白组、Gly-Gin二肽组、氨基酸组(Gly+Gin)和对照组，各试验组分别通过饮水添加250 mg/L已纯化的目的蛋白、50 mg/L Gly-Gln、35 mg/L Gin+15 mg/L Gly。饲养期3周，每周称重，试验结束时用MTT法检测血液和脾脏中T、B淋巴细胞的增殖活性，采用放射免疫分析法测定来自血液和脾脏的淋巴细胞培养液中IL-2和IL-6的含量。结果表明，通过饮水添加目的蛋白能够明显抑制血液和脾脏中T、B淋巴细胞增殖，但对血液和脾脏淋巴细胞分泌IL-2和IL-6有显著的促进作用。该作用效果与Gly-Gin二肽处理组完全一致，而Gly和Gln氨基酸组合处理却无此作用。 本试验成功构建了Gly-Gin多聚体原核表达系统，该系统能够高效表达Gly-Gin多聚体蛋白，表达的目的蛋白占总蛋白的40％左右。经小鼠饲养试验证明，目的蛋白经饲料喷涂或饮水方式添加，能够产生与Gly-Gin单体相同的生物学作用。