壬基酚(Nonylphenol，NP)是非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NonylphenolEthoxylates，NPEs)的主要成分。NPEs是目前全球商用第二大类非离子表面活性剂，主要用于生产洗涤剂、染料、农药等化工制品，这些化工制品在环境中经过生物降解转化为NP，因而造成其在河流、湖泊及海洋等水体环境中广泛存在。实验证实NP为一种环境内分泌干扰物，可对动物及人类雄性生殖系统产生很大影响。目前关于NP的研究大多集中于海洋鱼类，实验证实NP可引起鱼类生精细胞、支持细胞和间质细胞凋亡，改变鱼类精巢结构。对哺乳动物的研究发现，NP可降低大鼠精子生成的数量和质量。但是NP对动物，特别是哺乳动物雄性生殖系统构成危害的具体作用机制仍不清楚，迄今为止，国际上还没有开展过有关NP生殖毒性作用机制的系统研究。本研究以大鼠为实验对象，通过体内实验，从大体、组织、细胞、分子水平系统地探讨了NP对哺乳动物雄性生殖系统的影响，并以大鼠睾丸支持细胞、生精细胞为实验对象，通过体外实验，从细胞、分子水平进一步探讨了NP影响哺乳动物雄性生殖系统的作用机制。 第一部分NP对大鼠雄性生殖系统的影响一、目的从大体、组织、细胞、分子水平探讨NP对大鼠雄性生殖系统的影响及其作用机制 二、方法1、60只20天的雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为5组，即正常对照组(Control)、NP低剂量组(125mg/kg/d，NP1)、中剂量组(250mg/kg/d，NP2)、高剂量组(300mg/kg/d，NP3)、雌激素阳性对照组(1ng/kg/d，E2)，每组12只。分别将不同剂量的NP及雌激素溶于玉米油给动物灌胃，灌胃体积为1-2mL，对照组灌以同样体积的玉米油。60天后，颈动脉取血处死大鼠。 2、常规方法称取大鼠体重、附睾湿重，对附睾头精子计数；制作睾丸石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察、拍照；制作睾丸电镜切片，电子显微镜下观察、拍照；TUNEL法定位睾丸组织切片中的凋亡细胞；RT-PCR法测定睾丸组织中Fas和FasL的mRNA表达量；采用电化学发放仪测定血清中睾酮(Testosterone,T)、黄体生成素(LuteinizingHormone，LH)、卵泡刺激素(FollicleStimulatingHormone,FSH)和雌二醇(Estrogen，E2)的水平。 三、结果NP对大鼠体重、附睾湿重、附睾系数和附睾精子数皆有影响，NP浓度为125mg/kg/d时，附睾湿重即明显降低，NP浓度为250mg/kg/d时，大鼠体重、附睾系数和附睾精子数开始明显降低。NP的这些影响具剂量依赖效应，即NP剂量越大，影响越明显，且NP对雄性大鼠体重、附睾湿重、附睾系数和附睾精子数的影响与E2相似。组织结构观察显示：NP浓度为125mg/kg/d时，曲细精管生精上皮略薄，细胞层数稍有减少，但生精细胞仍然排列整齐；随NP浓度增加，生精上皮明显变薄，细胞层数显著减少，生精细胞排列松散，部分曲细精管管壁内精母细胞与精子细胞脱落，甚至堵塞管腔，其作用与E2相似。与此相应，超微结构观察发现，NP浓度为125mg/kg/d时，睾丸曲细精管管壁细胞胞内的空泡、溶酶体和脂褐素较Control组明显增多，随NP浓度增加，其细胞内空泡由小变大，融合成大空泡，溶酶体增多且肿胀，脂褐素增多更为明显，E2组睾丸曲细精管管壁细胞内也可见许多较大的空泡和脂褐素。TUNEL法对睾丸组织内凋亡细胞进行定位发现，NP浓度为125mg/kg/d时，曲细精管管壁内即出现棕色阳性颗粒，随NP浓度增加，阳性颗粒数目也相应增多，其数量与E2组曲细精管管壁内阳性颗粒接近。检测睾丸中Fas与FasLmRNA的表达量，结果显示：NP浓度为125mg/kg/d时，Fas与FasLmRNA的表达量即明显增加，但随NP浓度增加，无明显的剂量依赖效应。大鼠血清生殖内分泌激素检测结果显示：NP浓度为125mg/kg/d时，T水平略有下降，NP浓度为250mg/kg/d时，T水平明显下降，而LH、FSH水平则在NP浓度为125mg/kg/d时就开始明显上升。 四、结论NP可致大鼠睾丸组织结构受损，细胞结构改变，精子发生障碍，从而造成精子数量减少，质量下降，其作用结果与E2类似。主要作用机制为： 1、NP引起睾丸曲细精管管壁细胞凋亡(支持细胞)，通过Fas/FasL系统导致大量生精细胞凋亡。 2、NP抑制睾丸间质细胞分泌T，通过降低机体T水平影响精子发生。 第二部分NP对体外培养大鼠睾丸支持细胞的影响一、目的建立纯度高且稳定的支持细胞原代培养体系，在体外探讨NP对原代培养支持细胞的影响，进一步研究NP对大鼠雄性生殖系统影响的作用机制。 二、方法1、取出生28天的SD大鼠睾丸，采用改良方法分别以0.25％胰蛋白酶、0.1％胶原酶对其进行消化，分离得到支持细胞和生精细胞的混合液。培养36h后，以20mmolPH7.4的Tris-HCl缓冲液低渗处理1-2min，即得到纯度较高的支持细胞。以Feulgen染色法对其进行鉴定。 2、采用Feulgen染色法显示NP对支持细胞形态的影响，MTT法检测NP对支持细胞活性的影响，流式细胞仪检测NP对支持细胞凋亡率的影响，RT-PCR法检测NP对混合培养支持细胞、生精细胞中Fas和FasLmRNA表达量的影响。 三、结果对分离、纯化、原代培养的支持细胞进行Feulgen染色的结果显示：低倍镜下支持细胞胞核椭圆形呈紫色，胞浆呈淡绿色，胞质铺展，形状不规则，圆形的生精细胞已很少见，支持细胞纯度高达95％以上。高倍镜下支持细胞为多边形，其胞质极为丰富，相邻细胞的胞质互相连接形成网状，细胞核内清晰可见染色更深的双极小体。NP作用支持细胞后，其细胞形态出现异常，NP浓度为5μg/L时，出现细胞皱缩现象，胞质减少，细胞突起也相应减少，随NP浓度增加，支持细胞由含有丰富胞质的多边形变成仅含少量胞质的长梭形，甚至完全失去正常的细胞形态。检测NP对支持细胞活性的影响发现，3μg/LNP作用72h后，支持细胞活性显著降低，随NP浓度增加及作用时间延长，其活性下降更为显著。流式细胞仪检测NP对支持细胞凋亡率的影响显示：3μg/LNP作用72h后，支持细胞凋亡率即明显提高，随NP作用剂量增大，支持细胞凋亡率提高更加明显。与此相应，混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas与FasLmRNA表达量的检测结果显示：3μg/L、4μg/L、5μg/L的NP分别作用72h后，其Fas的mRNA表达量皆增多，FasL的mRNA表达量在3μg/L组略微下降，但在4μg/L、5μg/L组其表达量皆有所提高。 四、结论1、采用改良方法能够得到纯度高(95％)且稳定的支持细胞原代培养体系，对于深入研究支持细胞具有很大价值。 2、睾丸支持细胞是NP作用的靶细胞之一。NP可致体外培养的支持细胞形态异常，活性下降，并引起支持细胞凋亡。凋亡的支持细胞其FasL的表达量增加，对生精细胞的支持力下降，从而使生精细胞Fas的表达量增加，通过Fas/FasL系统引起大量生精细胞凋亡。 本研究的特色与创新：1、首次开展了NP对雄性哺乳动物生殖毒性作用机制的系统研究。 2、通过体内实验证明：NP一方面可引起睾丸曲细精管管壁内细胞凋亡(支持细胞)，通过Fas/FasL系统导致大量生精细胞凋亡；另一方面可抑制睾丸间质细胞分泌T，通过降低机体T水平影响精子发生。 3、通过体外实验进一步证明：睾丸支持细胞是NP作用的靶细胞之一。NP可引起支持细胞凋亡，使FasL的表达量增加，进而导致生精细胞Fas的表达量增加，通过Fas/FasL系统引起大量生精细胞凋亡。 4、率先采用改良方法建立了纯度高且稳定的大鼠支持细胞原代培养体系和鉴定方法，支持细胞纯度高达95％以上，达到国际水平。