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目的：PIAS(protein inhibitor of activated STAT)蛋白家族不但可作为SUMO连接酶促进底物发生SUMO化，从而调控转录因子的活性，也可作为构架蛋白，采用SUMO非依赖的方式，形成激活或抑制复合物来调节蛋白活性和功能。但是PIAS蛋白功能调节的机制目前还少有报道。蛋白质翻译后修饰方式很多，其中酪氨酸磷酸化修饰起到非常重要的作用。本室前期研究结果表明(1)Src激酶可以和PSD-95结合，(2)PIAS3可以和PSD-95结合。PSD-95作为脚手架蛋白，可以募集PIAS3和Src激酶，从而使后两者有在空间结构上发生相互作用的可能。因此，本课题拟研究Src激酶对PIAS3的酪氨酸磷酸化，并针对其分子机制展开研究。 方法：采用SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，分别给予SD大鼠侧脑室注射PP2(15μg)和PP3(15μg)来观察Src对PIAS3酪氨酸磷酸化的作用；侧脑室注射PSD-95反义寡核苷酸(10 nmol)和错义寡核苷酸(10 nmol)来观察PSD-95对PIAS3酪氨酸磷酸化的调控作用。采用免疫印迹方法检测蛋白质的表达水平，应用免疫共沉淀方法检测蛋白质之间的相互作用。采用激光共聚焦检测PIAS3亚细胞定位情况。 结果：1.大鼠全脑缺血0.25 h再灌注0.25 h，免疫共沉淀及免疫印迹结果表明PIAS3酪氨酸磷酸化水平升高。2.SD大鼠侧脑室注射PP2(Src激酶抑制剂)能抑制脑缺血再灌注诱导的PIAS3酪氨酸磷酸化水平的升高。将PIAS3质粒与Src质粒共转染到COS7细胞中后，采用激光共聚焦技术检测两者定位情况。结果显示，单转染PIAS3质粒，PIAS3主要表达在核中；共转染PIAS3质粒与Src质粒，PIAS3主要表达在胞浆中，并且与Src存在共定位。3.大鼠全脑缺血0.25 h再灌注1h，免疫共沉淀及免疫印迹结果表明，PIAS3与Pyk2结合水平升高。4.SD大鼠侧脑室注射PSD-95反义寡核苷酸能明显抑制脑缺血再灌注诱导的PIAS3酪氨酸磷酸化水平的升高。将PIAS3质粒与PSD-95质粒共转染到COS7细胞中后，采用激光共聚焦技术检测两者定位情况。结果显示，单转染PIAS3质粒，PIAS3主要表达在核中；共转染PIAS3质粒与PSD-95质粒，PIAS3主要表达在胞浆中，并且与PSD-95存在共定位。5.将野生型PIAS3(PIAS3 WT)及其酪氨酸点突变体Y270F和模拟酪氨酸磷酸化的点突变体Y270D分别转染进入COS7细胞中，采用激光共聚焦技术检测其定位情况，发现PIAS3 WT和PIAS3 Y270F主要定位于核内，PIAS3 Y270D主要定位于胞浆。 结论：1.脑缺血再灌注后，PIAS3酪氨酸磷酸化水平升高。2.Src介导PIAS3酪氨酸磷酸化。3.Pyk2参与PIAS3的酪氨酸磷酸化。4.PSD-95对PIAS3酪氨酸磷酸化有调控作用。5.PIAS3酪氨酸磷酸化改变其亚细胞定位。