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目的:本研究以人慢性粒细胞白血病K562细胞为研究对象,探讨蟾毒它灵对人慢性粒细胞白血病K562细胞增殖影响、衰老样表型的诱导作用及其机制研究。通过检测蟾毒它灵对K562细胞的增殖以及衰老相关分子mRNA水平、蛋白质水平变化以及细胞形态的影响,进而探讨蟾毒它灵诱导K562细胞衰老样表型的机制。方法:1.将对数生长期的K562细胞分为对照组和实验组(0.0078125μg/mL,0.015625μg/mL,0.03125μg/mL,0.0625μg/mL,0.125μg/mL,0.25μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL蟾毒它灵)培养24 h,48 h,72 h,96 h,利用CCK-8试剂盒检测蟾毒它灵对K562细胞的增殖能力的影响。2.将对数生长期的K562细胞分为对照组和实验组(0.01μg/mL,0.05μg/mL,0.1μg/mL蟾毒它灵)培养24 h,48 h,72 h,96 h,每天使用显微镜观察增殖情况变化并拍照。3.将对数生长期的K562细胞分为对照组和实验组(0.01μg/mL蟾毒它灵,0.01μg/mL蟾毒它灵+NAC,0.01μg/mL蟾毒它灵+PFT-α)培养96 h,每天使用显微镜观察其形态变化并拍照。4.将对数生长期的K562细胞分为对照组和实验组(0.01μg/mL蟾毒它灵,0.01μg/mL蟾毒它灵+NAC,0.01μg/mL蟾毒它灵+PFT-α)培养96 h,利用Real-Time PCR方法检测ROS抑制剂NAC,p53抑制剂PFT-α对蟾毒它灵诱导的衰老相关分子p53、p21的mRNA表达水平的影响。5.将对数生长期的K562细胞分为对照组和实验组(0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL蟾毒它灵)培养96 h,利用蛋白质免疫印迹法检测不同浓度蟾毒它灵对衰老相关分子p53、p21、p16、pRb的蛋白质表达的影响。6.将对数生长期的K562细胞分为对照组和实验组(使用浓度为0.01μg/mL的蟾毒它灵分别培养K562细胞24 h,48 h,72 h,96 h),利用蛋白质免疫印迹法检测蟾毒它灵作用不同时间对衰老相关分子p53、p21、p16、pRb、B-myb的蛋白质表达的影响。7.将对数生长期的K562细胞分为对照组和实验组(0.01μg/m L蟾毒它灵,0.01μg/mL蟾毒它灵+NAC,0.01μg/mL蟾毒它灵+PFT-α)培养96 h,利用蛋白质免疫印迹法检测NAC,PFT-α对蟾毒它灵衰老相关分子p53、p21、p16、pRb、B-myb的蛋白质表达的影响。结果:1.CCK-8结果及增殖情况拍照显示,蟾毒它灵对K562细胞具有显著的抑制增殖作用,并且随着蟾毒它灵的浓度升高以及时间的延长,其抑制作用越明显。2.根据形态学拍照结果显示,蟾毒它灵可以诱导K562细胞衰老样表型,这种结果通过使用ROS抑制剂或p53抑制剂预处理K562细胞可以有所减弱。3.实时荧光定量PCR结果显示,衰老相关分子p53/p21的mRNA表达水平增高,这种结果通过使用ROS抑制剂和p53抑制剂预处理K562细胞可以有所减弱。4.蛋白质免疫印迹法结果显示,蟾毒它灵可以诱导衰老相关分子蛋白的表达。衰老相关分子p53、p21、p16的蛋白质表达水平与蟾毒它灵浓度成正相关,pRb、B-myb的蛋白质表达水平与蟾毒它灵浓度成负相关。这种结果通过使用ROS抑制剂和p53抑制剂预处理K562细胞可以有所减弱。结论:1.蟾毒它灵可以显著抑制人慢性粒细胞白血病K562细胞增殖,并且其抑制作用随着浓度的增加、时间的延长逐渐增强。2.蟾毒它灵可以显著诱导K562细胞衰老样表型,其机制与p53/p21、p16/pRb信号通路的激活、抑制B-myb的表达相关。